IKBβ对内毒素引起心肌细胞损伤的影响

Cardiomyocyte injury is associated with mortality of septic patients. Our preliminary study showed that knockdown IKBβ expression with siRNA efficiently promote apoptosis and autophagy of cardiomyocytes. Therefore we propose the hypotheses that decreased IKBβ protein and phosphorylation state of IKBβ could activate NF-KB which is composed of different dimers and further influence the apoptosis-related or autophagy-related genes response to LPS.These events result in the cardiomyocyte injury. The exoeriments will be done with HL-1 cells in which IKBβ was overexpressed, knockdown or the point mutation in Ser-313 and Ser-315 of IKBβ.From the experiments, we hopefully get some useful information for the potential treatting target of sepsis.

心肌损伤与脓毒症病人死亡密切相关。预实验结果表明，LPS 刺激心肌组织后NFκB抑制蛋白IKBβ明显降低，IKBβ抑制心肌细胞凋亡和自噬。该项目提出LPS通过改变心肌细胞中IKBβ的蛋白表达量和IKBβ的磷酸化状态，活化由不同亚基组成的NFκB，并有可能通过改变细胞凋亡和自噬相关基因的表达影响心肌细胞对LPS的反应，造成不同程度的细胞损伤。实验用过表达IKBβ、siRNA敲减IKBβ和IKBβ丝氨酸磷酸化位点Ser-313、 Ser-315点突变的方法，观察IKBβ变化对NFκB活化、心肌细胞凋亡、细胞自噬及凋亡自噬相关基因表达的影响。该课题首次提出IKBβ的变化与受LPS刺激后心肌细胞的转归相关。该研究不仅为探讨IκBβ与脓毒症的关系奠定基础，也为防治脓毒症提供潜在靶点。

脓毒症是住院病人死亡的主要原因之一。而伴有心功能障碍的脓毒症病人其死亡率显着增高。内毒素与心肌细胞膜上的内毒素受体结合，通过活化核因子- Kappa B (NF-KB)，参与心肌损伤过程。IKBβ是NF-KB抑制蛋白的主要成员之一。脓毒症后IKBβ的Ser313位点低磷酸化,其能够进入细胞核,调控某些基因转录。本研究观察低磷酸化IκBβ对脓毒症所致心肌损伤的作用及机理。利用CRISPR/Cas9技术制备转基因小鼠，敲入低磷酸化IκBβ基因。制备小鼠盲肠结扎穿刺脓毒症模型，观察转基因鼠及野生型鼠死亡率，心肌损伤标志物改变，低磷酸化IκBβ的表达差异，炎症因子的表达量改变等。观察小鼠心肌组织中microRNA表达量的变化及对心肌细胞凋亡的影响。通过培养两种不同小鼠的原代心肌细胞，通过流式细胞术观察细菌内毒素刺激后心肌细胞的凋亡率，而后通过TUNEL染色观察凋亡的心肌细胞核占全部心肌细胞的比例。利用透射电镜观察自噬小体的变化，自噬相关基因在mRNA和蛋白水平的改变。结果显示：转基因鼠的低磷酸化IκBβ在脓毒症发生后持续表达。过表达低磷酸化IκBβ可显着降低脓毒症小鼠死亡率（64小时时野生型与转基因小鼠死亡率之比为100%：50%，p<0.05），减少心肌损伤标志物的改变（野生型小鼠脓毒症后心肌肌钙蛋白升高程度显着高于转基因小鼠，p<0.05），同时相关炎症因子改变也明显得到降低（野生型鼠脓毒症后的肿瘤坏死因子、白细胞介素-6及单核趋化蛋白1升高程度明显高于转基因小鼠，p<0.05）。促进心肌细胞凋亡的microRNA（主要是miR-26a、miR27a,miR-146a,miR-340）在转基因小鼠体内升高幅度显着低于野生型小鼠（p<0.05），细菌内毒素刺激的原代心肌细胞凋亡数量差异明显（转基因型显着低于野生型，p<0.05），TUNEL染色显示脓毒症发生后转基因小鼠心脏组织内细胞凋亡比例也显着低于野生型小鼠（p<0.05）。透射电镜结果显示转基因小鼠的线粒体损伤情况明显较轻，并且出现明显的自噬小体，而野生型鼠线粒体损伤十分明显，同时并未观察到自噬小体。实时定量PCR结果显示三磷酸腺苷酶表达量野生型小鼠明显高于转基因小鼠（p<0.05），而转基因鼠心肌组织中组织蛋白酶基因表达水平明显高于野生型小鼠（p<0.05）。同时蛋白印迹分析发现脓毒症后转基因鼠组织蛋白酶L表达升高