梅毒螺旋体膜蛋白Tp92与宿主细胞互作蛋白的筛选分析及功能研究

Syphilis is a kind of sexually transmitted disease that sigfificanly affects human public health. Since syphilis has the same transmission route with AIDS, it significantly increases the risk of infection and spread of AIDS. Treponema pallidum (T. pallidum) is the causative agent of syphilis. Screening of the human proteins targeted by Tp92, a major outer membrane protein encoded by Tp, and studying the related molecular interaction will facilitate to reveal the pathogenic mechanism of T.pallidum. On the basis of preliminary studies, On the one hand this project will use the membrane yeast two-hybrid system (MYTH) and mass spectrometry to identify the target proteins that interact with Tp92 protein. By analyzing the possible functional roles of the candidate proteins, we wish to explore the cellular molecular pathways caused by Tp92. These studies will help reveal the mechanisms underlying the interaction between pathogen proteins and human proteins and the virulences of syphilis as well. Above all, this project will establish an efficient molecular model to study the interactions between host proteins and syphilis,and will provide theretical and practical basis for treatment of syphilis-related diseases.

梅毒是一种严重危害人类健康的性传染疾病，其传播途径与艾滋病相同，且可明显增加感染和传播艾滋病的危险性。梅毒螺旋体（T.pallidum，Tp）是梅毒的病原体。Tp具有较强的侵袭力，外膜蛋白在其毒力中具有重要作用，而主要膜蛋白Tp92的致病机制目前尚未明了。筛选与Tp主要外膜蛋白Tp92相互作用的人宿主细胞靶蛋白从而预测其信号转导通路是揭示Tp致病作用机制的基础。本研究拟在课题组前期证实其有早期致炎作用的基础上，选择Tp早期感染所主要接触的人皮肤黏膜上皮细胞、微血管内皮细胞为靶细胞，运用专门研究膜蛋白相互作用的膜酵母双杂交系统（MYTH）和质谱技术鉴定与Tp92相互作用的人宿主细胞靶蛋白。通过分析候选蛋白的功能并研究蛋白可能的作用靶点，以此为进一步揭示梅毒致病的分子机制打下基础。

本研究通过研究梅毒螺旋体外膜蛋白Tp92与人单核细胞等细胞的相互作用，拟探索发现梅毒螺旋体可能存在一种能逃避机体固有免疫系统杀伤清除的免疫逃逸机制。为探索外膜蛋白Tp92对人单核细胞可能的影响，使用不同浓度的Tp92刺激THP-1细胞作用不同时间，观测THP-1细胞的生长情况和细胞因子的分泌水平. 随后进一步检测Tp92刺激后的THP-1细胞中的Caspase-1，3，8，9的酶活性和细胞死亡中关键分子的蛋白水平，同时通过封闭THP-1与细胞死亡相关的受体（TNFR1,FasL,TLR4,CD14,TLR2）检测细胞死亡率。在研究中用Tp92刺激提取的健康人的外周血单个核细胞，分别检测其中的单核细胞、DCs、T细胞占外周血单个核细胞的百分比和IL-8的分泌水平。本研究显示Tp92能引起THP-1大量死亡同时在一定程度上促进IL-8的分泌。Caspase-3，8，9的酶活性升高，而caspase-1酶活性没有升高，但焦亡的执行分子GSDMD被切割，caspase-1，3，8以及RIPK1的抑制剂能降低细胞死亡率，仅封闭CD14和TLR2后细胞死亡率降低。结果证实梅毒螺旋体外膜蛋白Tp92能经THP-1细胞表面的CD14 and/or TLR2，诱导人单核细胞发生由pro-caspase-1介导的焦亡和由RIPK1/caspase-8/caspase-3介导的凋亡，降低固有免疫应答系统清除梅毒螺旋体的能力。同时在检测细胞因子分泌过程中的关键分子NF-κB的蛋白水平以及封闭了与细胞因子分泌相关的受体(TLR4,CD14,TLR2)之后的IL-8分泌水平，发现NF-κB蛋白水平有部分升高，当使用NF-κB的抑制剂QZN后IL-8的分泌降低，仅封闭CD14和TLR2后抑制细胞分泌IL-8。从而证实Tp92能通过识别THP-1细胞表面的CD14 and/or TLR2，诱导IL-8的分泌，这种分泌能受到核转录因子NF-κB的调控，而细胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-10，IL-18，MCP-1的分泌水平未见明显升高。结果显示仅单核细胞百分比出现明显的减少伴同时IL-8有一定程度的升高。结论：梅毒螺旋体外膜蛋白Tp92在梅毒螺旋体早期感染宿主过程中能诱导人单核细胞死亡及IL-8的分泌，在应对宿主固有免疫应答系统识别和清除过程中发挥着重要作用。