高光胁迫下微拟球藻叶绿体适应性分子机制研究

Bioenergy is one of the most promising technologies to solve the uprising crises between energy supply, natural resources and environment pollution. Microalgae are considered to be one of ideal feedstock for bioenergy. However, microalgae, with characteristics of low light intensity acclimation, are grow slowly on the surface of culture result from high light stress in large-scale cultivation. The biomass loss in large-scale cultivation even reaches 20% due to the high light stress. This problem has become one of bottleneck in microalgae large-scale cultivation. In this study， Nannochloropsis oceanica IMET1, an excellent candidate for biofuel production, was selected for investigation in molecular mechanism of acclimation to high light stress. In this study, firstly, we will detect the morphologic and photosynthesis efficiency variation of Nannochloropsis cultivated in different light intensity, and then phosphorylation and complex varidiation of thylakoid membrane proteins during high light stress will be determined, subsequently, we will analyze chloroplast thylakoid membrane and matrix proteins differential expression during high light stress, and lastly, 2-3 key proteins will be deeply investigated. By the above investigation, molecular mechanism of acclimation to high light stress in Nannochloropsis chloroplast will be displayed. This study will provide theory foundation for genetic engineer for microalgae chloroplast, increase resistance to high light stress, improvement of photosynthesis efficiency in microalgae large-scale cultivation and development of Nannochloropsis new species with high photosynthesis efficiency.

生物质能源是解决目前所面临的能源、资源与环境问题最有潜力的途径之一，其中微藻被认为是比较理想的生物质能源原料。然而，由于微藻具有弱光适应性生长习性，在大规模培养过程中位于培养体系浅层的微藻处于高光胁迫状态，其总生物量损失甚至可以达到20%，高光胁迫已经成为导致规模化培养微藻生长缓慢的重要原因之一。本项目以具有应用潜力的微拟球藻为材料，围绕这一问题，采用组织学、生物化学和分子生物学手段，阐明高光胁迫下微拟球藻形态学和光合作用效率变化，解析高光胁迫下类囊体膜蛋白复合体的变化和磷酸化修饰，明晰参与高光胁迫的关键叶绿体类囊体膜蛋白和基质蛋白，并对2-3个关键蛋白进行详细功能解析，揭示高光胁迫条件下微拟球藻叶绿体适应性分子机制，为未来通过基因工程手段改造微拟球藻叶绿体的组成结构，提高其对高光胁迫的适应能力，改善规模化培养条件下光能利用率，创制高光效微拟球藻新品种奠定理论基础。

由于微藻具有弱光适应性生长习性，在大规模培养过程中位于培养体系浅层的微藻处于高光胁迫状态，高光胁迫已经成为导致规模化培养微藻生长缓慢的重要原因之一。本项目以微拟球藻为材料，首先对不同光照强度下色素含量和光合作用指标进行检测，较正常光照，低光照下色素含量略微降低，而高光胁迫下色素含量显著性下降，正常光照光合作用电子传递速率和光系统II量子产率最高，低光次之，高光最低。高光条件下光系统II和捕光色素复合体LHCII复合体条带均较中低光照条件下减少，而光系统I-LHCI条带含量增加。进一步对不同光照条件下光合作用关键蛋白表达水平进行检测，结果显示高光胁迫下D1蛋白较中低光照条件下表达水平降低，LHCII高光下表达量降低，高光条件下CP47含量未发生显著性变化，而低光条件下CP47含量提高，高光和低光条件下PsbO蛋白表达水平均较中度光照条件下提高，高光和低光条件下PsaA蛋白表达水平均较中度光照条件下提高，高光条件下Cyt f蛋白含量降低。磷酸化修饰是光合机构应对光损伤的重要防御方式，结果显示高光下LHCII、CP26、D2磷酸化修饰显著性提高。利用蓝绿温和胶双向电泳对高光胁迫条件下类囊体膜蛋白发生的适应性变化进行分析，结果显示共检测到112种类囊体膜蛋白，其中17种蛋白发生显著性差异表达，下调蛋白主要是捕光色素结合蛋白，上调蛋白包括钙网蛋白和ABC转运蛋白等。采用荧光定量PCR技术对上调蛋白进行验证，结果显示钙网蛋白在高光胁迫后其基因表达显著提高。为深入研究该基因功能，建立了稳定的微拟球藻遗传转化体系。随后测定过表达、RNAi转基因藻株和野生型藻株生长曲线、色素含量和叶绿素荧光指标等，结果显示转基因藻株和野生型相比并未发生显著性变化，可能该基因并非高光胁迫关键调控基因。通过蛋白质组学所获基因可能有一定的局限性。拟南芥具有与微藻本质相同的光合作用机制，由于基因表达的瞬时性决定了以水培养方式收集微藻（采收时间长）来进行此项研究具有一定的难度。本项目构建了拟南芥高光胁迫miRNA及mRNA的差异表达图谱，发现有8个miRNA以及200多个基因发生显著性差异表达，进一步利用荧光定量PCR技术验证了多个差异表达的miRNA及其靶基因。本项目最后利用重离子诱变创制了两株高光效微拟球藻新品种，对其生长、色素含量以及光合作用指标等进行了测定。