微拟球藻中性脂及脂肪酸代谢调控的分子机理研究

Microalgal biodiesel has currently attracted worldwide attention. However, the content of neutral lipid (represented by TAG) and the compositon of fatty acids which depend on gene expression decide the quantity and quality of biodiesel. Microalgal species with optimal content of neutral lipid and compositon of fatty acids are expected to achieve by modification of key genes. And then the microalgal biodiesel products will be obtained through the mass breeding. Nannochloropsis have been proposed as one of the excellent candidates for fuel production with rich lipids, high growth rate and stress resistance. Nannochloropsis are considered as fine material for breeding because of their nuclear ploidy and asexually reproductive strategy. The availability of the whole genome information and the establishment of random integration and efficient homologous recombination technology laid the foundation for the research on metabolic regulation. This study will analyze its transcriptome and its content of neutral lipid and fatty acid after changing the ecological condition of Nannochloropsis oceanica to explore the molecular mechanism of neutral lipid and target fatty acid synthesis, find the restrictive nodes of the synthesis pathway and screen the valuable key genes for metabolic regulation. All these will lay the foundation for the modification of key genes of neutral lipid synthesis pathway with genetic engineering in N. oceanica

当前，微藻生物柴油备受青睐，微藻总脂中以三酰甘油为代表的中性脂含量及其脂肪酸组成决定其生产生物柴油的数量和质量，而中性脂含量和脂肪酸组成是由微藻自身基因表达所决定的，通过修饰主控或者关键基因，有望培育出中性脂含量及其脂肪酸组成合适的藻种，进而通过规模化养殖，生产人类所需的微藻生物柴油产品。微拟球藻富含油脂、生长快、抗逆性强，被认为是优良产油微藻之一；其细胞核单倍，无性繁殖，是育种良材；全基因组测序工作的完成，随机整合和高效同源重组技术的建立，为其代谢调控研究奠定了基础。本项目拟通过改变培养微拟球藻的生态条件，对其进行转录组学、中性脂及脂肪酸含量分析，探索其中性脂及目标脂肪酸合成路径的分子机制，廓清其合成的限制节点，筛选对其代谢调控具有应用价值的主控或关键基因，为利用基因工程对微拟球藻进行中性脂合成相关路径的关键基因进行修饰奠定基础。

以微拟球藻大洋种（N. oceanica LAMB0001）为研究对象，对多不饱和脂肪酸（PUFAs）合成及甘油三酯（TAG）合成所涉及的关键酶基因进行了生物信息学分析，确定了研究的候选基因，为通过基因转化确定这些酶基因的功能，提高该藻的油脂含量和中性脂含量奠定了基础。.克隆了微拟球藻硫脂酶基因（NoTE），在大肠杆菌中验证了功能，表明过表达微拟球藻硫脂酶基因不能改变大肠杆菌的脂肪酸种类，但C14:1、C16:0、C16:1、C18:1及总脂肪酸含量分别提高了11%、18%、32%、49%和30%，证明该基因在大肠杆菌中具有酶活性，能促进脂肪酸的积累与释放。.探索了限氮、限磷及不同温度对微拟球藻总脂含量、脂肪酸组成及硫脂酶基因转录的影响，表明微拟球藻硫脂酶基因转录水平及油脂含量随限氮/限磷时间延长而升高；氮/磷缺乏可抑制多不饱和脂肪酸合成，促进饱和脂肪酸与单不饱和脂肪酸积累；硫脂酶基因转录水平随温度升高而上升，饱和脂肪酸含量增加，20℃时达到最高。.建立了微拟球藻的转基因体系，通过同源重组及过表达进行基因改造，阐明了这些基因在相关代谢途径中的重要性，初步确定了相关代谢途径中的关键基因。研究结果表明，尽管微拟球藻同源重组的效率较低，但却具有很高的随机整合效率；在该藻株中过表达了微拟球藻的Δ6去饱和酶基因(NoD6)、Δ12去饱和酶基因(NoD12)，三条二酰甘油酰基转移酶基因（DGAT基因，两条来自三角褐指藻，一条来自拟南芥），获得了总脂含量升高的转化藻株，其中H6、 M17和N4的总脂含量比野生型藻株的总脂含量(18.98%)分别提高了4.20%、2.77%和5.77%，同时获得了PUFA含量增加的转基因藻株。.综上，微拟球藻硫脂酶基因（NoTE）能促进脂肪酸的积累与释放，Δ6去饱和酶基因(NoD6)、Δ12去饱和酶基因(NoD12)是PUFAs合成的关键酶记忆，二酰甘油酰基转移酶基因（DGAT）是总脂及甘油三酯（TAG）合成的关键酶基因。