真菌作用HIV-1整合酶靶点的活性成分研究

目前抗AIDS药物的研究还主要集中在HIV-1逆转录酶、蛋白酶和整合酶抑制剂的筛选上。逆转录酶抑制剂多为核苷类似物，会因病毒的变异而失效。蛋白酶在生物体内广泛存在，所以抑制HIV-1蛋白酶的药物也对人体有毒副作用。而HIV-1整合酶在生物体内没有同源类似物，因此是很好的抗病毒靶点。本项目以真菌抗氧化物质研究为切入点，用拟建立的抗HIV-1整合酶筛选模型为靶标，从真菌抗氧化物质中筛选出抗HIV-1整合酶的活性成份。在此基础上，利用TNF-a-Luc报告基因小鼠模型和带AIDS病毒LTR-EGFP报告基因的BHK21仓鼠肾细胞系，评价真菌抗氧化物质作用整合酶靶点的活性成份对TNF-a和tat基因表达水平的影响，从而获得能降低NF-κB活性的真菌多效抗AIDS成分，以克服现有专一性酶抑制剂作用单一，抗病毒株一旦出现就完全失效的问题，为天然抗AIDS药物的开发与利用奠定理论基础。

整合酶是HIV-1三大关键酶之一，因其在人体内没有同源类似物，理论上抑制整合酶的药物对人体其它相关酶类影响最小，是很好的抗HIV-1研究的靶点。但至今在32种被FDA批准上市的抗HIV-1药物中只有一种为整合酶抑制剂。其原为目前还未有快速、有效、可以进行大规模药物筛选的整合酶抑制剂检测模型。因此，导致抑制整合酶的药物研究与开发缓慢。 .本研究集中在抗HIV-1整合酶活性成分筛选模型的构建。研究出三个整合酶抑制剂筛选模型：1、整合酶体外切割底物质粒筛选模型，首先通过PCR技术引入F185K和C280S两个突变位点于HIV-1整合酶cDNA片段中，构建出HIV-1整合酶可溶性表达质粒和带有整合酶最适底物LTR序列的质粒，在大肠杆菌中大规模制备纯化整合酶，以便克服已有ELISA检测法成本高、本底高、影响因素多等缺点，可在体外大量而快速的对各种天然或化学合成的整合酶抑制剂进行初步筛选。2、整合酶抑制剂细菌胞内双质粒筛选模型：用pET-IN和pLTR两种质粒共转化大肠杆菌，筛选双抗性、带有双质粒的菌株。通过监测大肠杆菌表达HIV-1整合酶时的生长情况来评价样品对HIV-1整合酶的抑制作用。3、整合酶抑制剂酵母胞内筛选模型：通过酵母中DNA修复蛋白能修复整合酶对酵母基因组的切割，使酵母生长正常；而在RAD52缺陷性菌株中，整合酶对酵母基因组的切割无法修复，菌株的生长明显受抑制。所以，首先用cre/loxp法，定点敲除RAD52基因，再转化进入HIV-1整合酶基因，又建立一种快速、简便的HIV-1整合酶体内筛选模型。这三个模型的构建，使本实验室建立了一套完整、快速、简便的抗HIV-1整合酶抑制剂筛选体系，为以HIV-1整合酶作为靶点筛选和研究抗HIV-1活性成分奠定了基础。.利用以上模型，对干巴菌中筛选出一种多酚类抗氧化成分，分子式为C25H20O12，分子量约为513 Da、对黄伞中筛选出一种没食子酸甲脂抗氧化成分，分子式为C8H8O5，分子量为184.1 Da，进行测定，两个成分都有抗HIV-1整合酶活性。接着对在氧化应激过程中细胞内NF-kB信号激活通路，以及抗氧化成分通过保护作用间接抗HIV-1整合酶机制进行了探讨。双氧水能刺激NF-kB的活化，使抑制蛋白降解。而抗氧化成分能抑制NF-kB p65活化和防止IkB降解，抑制氧化应激，从而间接达到抗HIV-1整合酶作用。