EBV-LMP1对鼻咽癌干细胞增殖侵袭的影响及其机制研究

鼻咽癌是我国高发恶性肿瘤，目前临床以放疗和化疗为主，但副反应明显，探寻鼻咽癌病因及新的防治方法很有必要。鼻咽癌病因不清，研究发现与EB病毒关系密切。近年来肿瘤病因学研究较多的是癌基因学说和肿瘤干细胞学说，但两种学说的相关性研究国内外未见报道。.本课题选择在鼻咽癌发生、发展及转移中起重要作用的癌基因EBV-LMP1和鼻咽癌干细胞为研究对象，通过靶向抑制（前期实验筛选的特异性脱氧核酶及siRNA）EBV-LMP1后，观察对鼻咽癌干细胞增殖、侵袭等生物学影响，并结合基因表达谱、蛋白表达谱和常见信号传导通路（STAT3/AP-1/NF-κB/MMP9）对其机制进行研究，探讨癌基因EBV-LMP1在鼻咽癌干细胞中的作用及其机制，为丰富鼻咽癌干细胞学说和促进癌基因与癌干细胞相关性研究提供实验基础，为临床上通过癌基因和肿瘤干细胞双向途径进行靶向抑制从而防治鼻咽癌提供新的策略，有重要的理论和现实意义。

本项目成功建立了绿色荧光融合表达LMP1的HNE1 、CNE2细胞等培养系统，并利用该荧光可视化系统成功筛选出高效抑制LMP1表达的特异性脱氧核酶DZ509和DZ167。通过对鼻咽癌细胞株CNE2、C666-1进行肿瘤标记物CD133、 CD44的免疫荧光检测发现，CD133阳性率较低（4.5%-6.2%），CD44阳性率高（92.2%-98.4%）。BALB/C裸鼠皮下成瘤实验表明C666-1较CNE2更易成瘤。靶向脱氧核酶（DZ509）靶向抑制LMP1 后，鼻咽癌细胞株C666-1凋亡率增加，增殖率下降，表明LMP1的致瘤性可能与肿瘤干细胞有关。我们尝试了多种肿瘤干细胞的分离方法。使用流式细胞仪筛选出CD133+细胞、CD44+细胞和CD133+ CD44+细胞，从C666-1和CNE2分离的细胞数量都较少（＜1%），状态较差。利用荧光染料（Hoechst33342）分别结合流式细胞仪和免疫磁珠细胞分选器(MACS)分选出侧群细胞（SP细胞）发现：LMP1 阴性的CNE2分离的 SP 细胞数量较少（＜5%），成活能力较差；LMP1 阳性的C666-1中分离的SP 细胞数量较多（＜9%），成活能力较好，但培养3-5天后发现大部分死亡，不能进行增殖侵袭凋亡等功能检测。分离出的SP细胞直接注射BALB/C裸鼠皮下，观察3周仍无成瘤。利用微球体培养法，发现少部分细胞可在第7天左右形成微球体，而大部分细胞死亡，对微球体细胞进行消化后传代培养时，发现细胞容易死亡，生长缓慢。上述方法分选出的肿瘤干细胞稳定性较差，仍需要进行条件优化探索。鼻咽癌肿瘤干细胞常用分选方法都不太稳定，我们正在进行悬浮培养法及结合有限稀释法进行肿瘤干细胞筛选，取得一定进展。鼻咽癌肿瘤干细胞稳定的分离筛选平台值得进一步探索研究。