GhYUCCA1基因在棉花纤维细胞分化中的功能研究

研究纤维细胞发育的分子机理，不仅有重要的理论意义，而且对棉花生产有巨大的潜在应用价值。生长素在细胞的分化、器官发育过程中起重要的调控作用。研究证明无论是离体还是体内，用IAA处理棉花胚珠，均可促进纤维细胞的发育。我们通过转基因技术内源增加开花当天胚珠中IAA含量，显著提高了胚珠的纤维细胞数目。然而，直到现在对胚珠自身IAA调控纤维细胞分化的分子机理以及有关纤维细胞分化的IAA合成的调控机理却仍不清楚。申请者从陆地棉中克隆了9个IAA合成途径中关键的YUCCA类基因，表达分析表明GhYUCCA1在花蕾和开花前一天胚珠中表达。在此基础上，本项目拟从IAA的合成途径入手，利用反向遗传学手段，研究该基因在陆地棉纤维分化过程中的功能。通过对启动子特异调控元件的研究，筛选上游可能的调控基因，为探索生长素调控棉花纤维细胞分化和发育的分子机理提供理论依据。

从陆地棉中克隆了GhYUCCA1基因，氨基酸序列比对分析发现GhYUCCA1与其它植物的类黄素单加氧合酶具有较高同源性，该基因在开花前1d的胚珠中表达量最高，其次是花蕾中。拟南芥中超量表达GhYUCCA1基因，转基因植株出现矮化、叶片卷曲的表型，在根中特异表达该基因，可抑制根的生长，因此，该基因具有催化合成生长素的功能。为了解析GhYUCCA1基因在纤维发育中的功能，应用RNAi技术获得了39株转基因棉花植株。其中RI3-1植株中GhYUCCA1的表达量不到野生型的10%，GhYUCCA3、GhYUCCA4、GhYUCCA7、GhYUCCA9、GhYUCCA10基因表达量也降低，但GhYUCCA2表达量上调。在所有检测的转基因株系RI3-1、RI3-2、RI3-5、RI15-1和RI30-2中，开花当天胚珠表皮的纤维突起数目均少于野生型。其中RI3-1株系减少的最多，只有野生型的66.4%，结果表明GhYUCCA1促进了棉花胚珠表面纤维细胞的起始。成熟棉纤维长度测定结果显示：与野生型棉花相比，RI3-1、RI3-2、RI3-8、RI6-1、RI15-4和RI30-2转基因棉花纤维长度分别减少了13.5％、4.8％、7.2％、10.7％、6.0％、8.1％，均达极显著水平(p<0.01)。说明GhYUCCA1基因能够促进纤维细胞的起始与伸长。克隆了1.9kb的 GhYUCCA1的5’上游片段，该片段含有多个顺式调控元件，与GUS基因融合后转入烟草并进行表达分析，发现该启动子在茎、种子表皮中表达。除水杨酸(SA)外，高温、低温、油菜素内酯（BL）和茉莉酸（MeJA）均不能诱导该启动子的表达。此外还研究了棉花生长素结合蛋白（GhABP1）中半胱氨酸和C端多肽的功能。结果证明GhABP1在去除了C端α螺旋序列后，其功能丧失，但却没有竞争正常ABP1的结合位。GhABP1的C端多肽可能是且是唯一的ABP1锚定和活性结构域。157位半胱氨酸的突变导致了GhABP1功能的丧失，3、63位半胱氨酸的突变则没有降低GhABP1在高浓度NAA下的活性。因此，第三位半胱氨酸的突变没有影响GhABP1的功能；第63位半胱氨酸的突变则是GhABP1对生长素的敏感度增加。