表达禽流感病毒抗原重组鸭病毒性肠炎病毒诱导特异性快速免疫保护的机制

It is very important to elucidate the mechanism of duck enteritis virus-vectored bivalent live vaccine induced rapid protection against H5N1 virus in ducks . Our previous studies revealed a single dose of rDEV-HA could induce complete protection against the lethal dose of H5N1 virus challenge in as little as 3 days postvaccination (Liu J, et al. J Virol. 2011). This study is aim to initially outline the mechanism of rapid protection of attenuated vaccine. we'll construct a series of recombinant of DEVs (rDEVs), which expessing different patterns of HA gene,such like membrane-binded,secreting or intracellular expressed. The protective efficiency will be evaluated in ducks, and then, the function of different lymphocytes will be defined. The rDEVs which could induce rapid protection postvaccination will be used as the model virus. Different cytokine and the IgM, IgG and IgA will be detected from day 1 to 10 postvaccination. meanwhile, in order to determine the T cells function in rapid protections, CD4+ and CD8+ antibodieswill be used to temporarily depletethe corresponding T cells before vaccination. The contributions of the early non-neutralizing antibodies, cytotoxic lymphocytes and innate immunity will be defined in rDEVs induced rapid protections. The results of this study will give us some useful guidence for the development of prophylactic vaccines.

探索疫苗诱导快速免疫保护机制具有重要理论和现实意义。申请者前期研究证实，表达禽流感病毒（AIV）HA 抗原的重组鸭病毒性肠炎病毒（DEV）接种鸭，免疫3 天后即可对H5AIV 攻击产生特异性免疫保护。本研究拟以此为模型对快速免疫保护机制进行研究。首先构建分别表达嵌膜、分泌或胞内状态的HA抗原的重组DEV（rDEV），比较不同抗原形式和加工、提呈方式对rDEV 免疫效力及诱导快速保护能力的影响。通过上述实验筛明能诱导快速保护的rDEV，用于接种鸭，检测免疫后早期固有免疫相关细胞因子的活化情况及免疫后1-10天体液中特异性IgM、IgG、IgA 抗体产生情况；并用鸭CD4、CD8 分子特异性单抗，分别消除鸭体内相应T 淋巴细胞，进一步探讨早期非中和性抗体、细胞毒淋巴细胞及固有免疫系统对重组病毒诱导的特异性快速免疫保护的贡献。本研究结果将对紧急预防疫苗与治疗性疫苗的研制与应用产生积极影响。

传统观点认为，外源病原感染宿主后，前96小时为固有免疫应答阶段，适应性免疫应答发生于感染后96小时；而疫苗免疫动物后，有效的特异的免疫保护产生时间出现在免疫后7-10天左右。申请者前期研究证实，表达H5禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）HA基因重组鸭病毒性肠炎病毒（Duck enteritis virus, DEV）疫苗能诱导特异的快速的对同源高致病性禽流感病毒（HPAIV）的攻击保护，用该疫苗免疫3天后即可对H5禽流感病毒攻击产生特异性免疫保护。本研究拟以此为模型对快速免疫保护机制进行研究。首先，研究者分别构建了表达嵌膜、分泌或胞内状态的HA抗原的重组DEV（rDEV），用其免疫SPF鸭，比较不同抗原形式和加工、提呈方式对诱导快速免疫保护能力的影响。其次，通过与传统灭活疫苗比较，用重组疫苗和灭活疫苗分别免疫鸭后，通过检测免疫后早期IFN-α，IL-4，IL-6，TNF-α等固有免疫相关细胞因子的活化情况评价rDEV免疫鸭后诱导固有免疫活化情况。同时，观察免疫后1-10天血清和粘膜分泌液中特异性IgM、IgG、IgA抗体产生情况，并进一步检测重组病毒免疫鸭后早期体内CD4+ /CD8+ T淋巴细胞含量比例，及特异性CD4+ 和CD8+ T 淋巴细胞活化情况，分析细胞免疫应答产生情况。研究结果表明，禽流感病毒HA基因的完整表达是诱导有效免疫保护的必要条件。II型干扰素IFN-γ诱导的细胞免疫和Granzyme-A诱导的细胞毒性T细胞作用很有可能是促使机体产生快速免疫应答反应的关键因素。同时，重组鸭瘟病毒弱毒疫苗株刺激诱导的细胞免疫在发挥快速免疫过程中也起到一定作用。