基于细胞代谢-转运组学技术筛选异烟肼肝损伤的早期标志物

Drug induced liver injury (DILI) has been a problem of medication safety. However, diagnosis in clinic can't predict DILI early,and new DILI markers reported at home and abroad can't meet the clinical requirements. Two interesting phenomenons have been firstly found in the previous project: 1. after treatment by isoniazid, hepatobiliary membrane transporters medicated transport of bile acid and bilirubin were adjust reversibly.ATP-binding cassette (ABC)transporter increased compared with sailing control group, while Multispecific solute carrier (SLC) were decreased; 2. the change of hepatobiliary membrane transporters (HTM) was earlier than biomarker indicators and liver tissue pathology.Since changes in the HMT can cause changes of endogenous substances in liver cell and bile, the aim of this research will to find speical tansporter (ST) and screen endogenous substances from hepatobiliary internal liquid and bile by binary omics which is combination of transportomics and metabonomics.Then the prediction model of endogenous substances in blood or/and urine were investigated, and the early marker of liver injury induced by isoniazid were determined.It will provide the basis for clinical application of isoniazid-induced liver injury.

药物性肝损伤(DILI)威胁着患者的用药安全，而临床常用诊断手段不能早期预测DILI，且国内外报道的新DILI标志物也不能满足临床需要。课题组在前期研究中首次发现了2个有趣的现象：1、等效剂量异烟肼干预小鼠后，肝细胞膜上主要与胆红素及胆盐相关的外排型与摄取型转运体的表达呈现规律性变化；2、这些转运体显著变化的时间远在常规生化指标和病理学异常之前。因肝细胞膜转运体的变化直接导致肝细胞内液及胆汁中内源性底物浓度的改变，课题组拟进一步明确异烟肼诱导常见肝细胞膜转运体Bsep、Ntcp、Bcrp、Oct1、Oat1、Mdrs、Mrps和Oatps的变化规律，采用细胞代谢组学与转运组学相结合的方法，从肝细胞内液及胆汁中寻找特异性转运体所介导的相应内源性底物，通过化学计量学构建其与血液和/或尿液中内源性物质的关系，并从中筛选出能预测异烟肼肝损伤的早期标志物，以期为临床早期预测异烟肼肝损伤奠定基础。

药物性肝损伤(drug induced liver injury, DILI)已成为严重威胁患者用药安全的临床问题，而临床常用诊断手段不能早期预测DILI，而我国作为结核疫情重灾国之一，因抗结核药引起的肝损伤位居各种DILI病因之首，因此，本项目以抗结核一线用药异烟肼为研究对象，基于前期研究发现“转运体变化早于生化和病理变化”，拟从早期变化转运体所介导的内源性物质中筛选出可预测致肝损伤的早期标志物，以期为临床早期预测异烟肼肝损伤奠定基础。首先，项目组采用病理学、肝细胞形态学、生化指标、免疫印迹、免疫组化和RT-PCR技术分别考察了不同剂量、不同用药周期异烟肼干预下大鼠的肝损伤程度和肝细胞膜转运体的变化规律，采用主成分分析筛选出了发生显著变化的时间明显早于血生化指标及病理学异常的特异转运体（special transporters, ST）Bsep、Ntcp、Mrp2、Mrp4和Oatp2。其次，课题组采用细胞代谢-转运组学技术在胆汁、尿液、血液和细胞内液中筛选每个ST的底物，但研究结果发现ST所介导的底物具有非特异性，且同家族的转运体间具有代偿性协同作用，导致通过该技术所筛选的单个底物不能有效预测异烟肼所致肝损伤程度，但所有ST的底物中大部分为不同形式的胆酸盐，且胆酸盐中各组分谱的变化却与异烟肼所致肝损伤程度具有密切关联，为此，课题组将预测异烟肼肝损伤的早期标志物锁定在胆酸盐中，并构建了可同时测定45种胆酸盐的UPLC-MS/MS色谱方法，通过测定异烟肼对大鼠或HepRG细胞胆酸盐谱的影响，筛选出与异烟肼肝损伤密切相关的胆酸盐组，通过主成分分析筛选出可作为潜在标志物的胆酸盐组，再通过动物实验和细胞凋亡实验反复验证，最终成功筛选出3种与异烟肼肝损伤程度密切相关的早期标志物DCA、CDCA和TDCA。此外，项目组用胆酸盐谱对药物性肝损伤的三种类型：细胞损伤性、胆汁淤积性和脂肪病变型进行了成功鉴别，且研究发现胆酸盐谱还可有效评价保肝药物的药效。因此，本项目发现了可有效预测异烟肼肝损伤程度的早期标志物，且为其它药物性肝损伤的早期预测、诊断和保肝药效的评价研究提供了新的研究思路。