厌氧甲烷氧化耦合高氯酸盐脱氯的微生物学机理研究

Perchlorate contamination in groundwater is frequently reported recently, the most studies of perchlorate reduction utilized hydrogen or organic compound as electron donor. A very recent study showing that a micro consortia was able to anaerobically reduce perchlorate using methane as electron donor, however, the microbial mechanism is unknown yet. Thus, we propose to study the anaerobic methane oxidation coupled to perchlorate reduction (ANMO-PR) mechanism by a combination of multiple advance technologies, based on the ANMO-PR culture enriched in our lab. We will study the metabolic behavior, e.g. metabolic pathway of the ANMO-PR process by suppressing the activity of PMO or MCR enzyme when the culture using isotope 13CH4 as sole electron donor and carbon source; we will study the effects of environmental factors, including nitrogen source, e.g. ammonia or nitrate, different concentrations of electron acceptors, different concentrations of chlorate and chlorite, and different concentrations of oxygen on the metabolism of ANMO-PR; we will study the variation of functional genes abundances and their expression under different ANMO-PR conditions by using qPCR and RT-PCR; we will study how the microbial community structure changes associate with different ANMO-PR conditions by using high throughput sequencing technology and mega-data analysis approach. We will isolate and characterize pure strain able to anaerobically reduce perchlorate using methane as the sole electron donor and carbon source, by the whole genome sequencing and assembling. By conducting such experiments, we will be able to address the metabolic mechanism of the ANMO-PR process, which is of great interest and importance for bioremediation of groundwater.

环境水体特别是地下水中高氯酸盐污染日趋严重，以往高氯酸盐生物还原多以有机物或氢气为电子供体。本团队最近研究表明，一类微生物可以利用甲烷为电子供体厌氧还原高氯酸盐，但该过程的微生物学机理并不清楚。本项目以厌氧甲烷氧化耦合脱氯菌群为研究对象，以甲烷作为电子供体，用溴乙烷磺酸和乙炔抑制甲基辅酶M还原酶或甲烷氧化单加氧酶酶活，利用同位素示踪、离子色谱、气质联用等技术，研究该菌群氧化甲烷耦合脱氯的代谢行为；比较不同无机氮源、不同电子受体、不同浓度氯酸盐及亚氯酸盐、氧气等环境因子对该菌群代谢行为的的调节机制；利用荧光定量PCR、高通量测序及数据分析技术，分析关键功能基因在不同氧化甲烷氧化耦合高氯酸盐脱氯条件下的丰度与表达，研究该厌氧甲烷氧化耦合脱氯菌群的生理生化特征；通过纯菌分离鉴定及全基因组序列分析，进一步明确单菌株厌氧甲烷氧化耦合高氯酸盐脱氯的生物学机理。为地下水高氯酸盐污染生物还原提供理论支撑。

甲烷是城市污水处理系统中剩余污泥厌氧消化的产物，同时也是一种重要的温室气体，合理利用消化过程产生的甲烷是有效控制碳排放的重要手段。近年来，人们发现微生物进行的甲烷厌氧氧化(Anaerobic methane oxidation, AnMO) 可以耦合硝酸盐、亚硝酸及铁锰的还原，这为污水处理过程中碳源循环及深度脱氮提供了新的思路。进一步的研究表明高氯酸盐也可作为AnMO耦联反应的电子受体，但有关甲烷厌氧氧化耦合高氯酸盐脱氯（AnMO-PR）的微生物学机理不明，严重限制了该微生物学过程及甲烷氧化反硝化过程在地下水污染控制中的实际应用。. 本项目旨在通过同位素示踪法揭示混合菌群厌氧甲烷氧化耦合高氯酸盐脱氯的微生物代谢途径；利用微生物代谢动力学及宏基因组学分析厘清环境因子硝酸盐、盐度及氧气等对AnMO-PR过程及菌群微生物生态结构的影响；进一步通过功能酶活抑制实验探明菌群在不同条件下AnMO-PR过程的功能酶活变化和微生物响应机制。. 同位素标记实验表明，在厌氧条件下，AnMO-PR可能遵循类似“逆向产甲烷”途径的过程，即甲烷八叠球菌通过逆向产甲烷产生电子并将其传递给高氯酸盐还原菌进行高氯酸盐的还原。同时反应器中也检出了好氧甲烷氧化菌，这些菌群有可能利用亚氯酸盐歧化产生的氧气进行好氧甲烷氧化。硝酸盐会对ANMO-PR产生可逆性抑制，当硝酸盐和高氯酸盐共存时，微生物会优先利用硝酸盐，原因是硝酸盐还原过程中质子和电子转移需要的能垒较低。微生物群落分析表明，反应体系中的优势菌种主要为甲基氧化菌群和高氯酸盐还原菌群，随着反应进行，甲基氧化菌群因缺氧而丰度减少，高氯酸盐还原菌群的丰度随着污染物负荷增加而升高。功能酶活抑制实验显示，2-溴乙烷磺酸可以显著抑制逆向产甲烷过程中的关键酶mcrA的活性，从而降低高氯酸盐的还原速率。微量氧气(0.5-1.0 mg/L)可以有效促进甲烷氧化耦合高氯酸盐还原的速率，而过高的氧气浓度(≥2.0 mg/L)又会抑制高氯酸盐的还原。. 这些结果为去除环境中高氯酸盐污染提供了新的理论依据，也会为温室气体减排及资源利用提供了新思路。