花生GLP基因抗黄曲霉功能研究

黄曲霉毒素污染已严重影响我国花生产业化发展及消费者身体健康，而相应抗性育种进程缓慢使解决毒素污染问题任重道远。本项目拟在前期花生种子蛋白质组学研究基础上，克隆经蛋白质组学分析证明与花生抗黄曲霉相关的花生germin-like蛋白（germin-like protein GLP）基因。通过原核表达鉴定GLP基因酶活性功能，并通过构建植物超表达载体转化花生，对转基因植株进行相关的基因表达和抗性分析，明确GLP在花生收获前对黄曲霉的抗性功能。同时，将抗感种质收获后的花生种子进行萌发复水并接种黄曲霉处理，对处理前后的种子进行GLP基因表达和酶活性分析，以及进行GLP原位组织活性检测。探明GLP在抗花生收获后黄曲霉侵染与产毒机制中的作用。通过本项目的实施将分离克隆花生GLP基因，并确定花生GLP基因对黄曲霉抗性功能。这对明确花生抗黄曲霉污染的抗性机制，培育抗性品种有着重要的理论和实际意义。

本项目在前期开展黄曲霉诱导的花生种子蛋白质组学研究中鉴定一些差异表达蛋白点，其中花生gemin-like蛋白（AhGLP）是在抗性品种中特异表达且表达量最高的蛋白点之一。序列同源分析表明花生AhGLP是一个多基因家族，本项目中共鉴定了13个花生AhGLP基因，生物学信息学分析结果表明，AhGLP家族蛋白质都有相似的氨基酸组成和三级结构，其序列同源性为27%-99%，而与其它物种GLP家族蛋白质的同源性为32%-79%。采用荧光定量PCR对AhGLPs家族基因在花生根、茎、叶、花、花蕾以及种子发育和萌发过程的表达情况进行分析，结果表明花生GLPs家族基因在不同的组织或器官以及不同发育过程均存在很大差异。对花生AhGLP家族基因在花生抗黄曲霉侵染研究表明：在干旱的条件下花生AhGLP家族的5个成员基因(AhGLP1a, AhGLP2, AhGLP3a, AhGLP4a 和AhGLP5a)可能与抗收获前黄曲霉毒素污染相关；而AhGLP家族各成员基因在收获后受黄曲霉菌侵染的花生种子中均显著上调表达；原核表达花生AhGLP家族基因，纯化AhGLP蛋白进行黄曲霉抑菌实验表明AhGLP蛋白并不直接抑制黄曲霉菌生长和产毒；对AhGLP蛋白酶活分析表明部分AhGLP蛋白具有锰离子结合的超氧化物歧化酶（Mn-SOD）活性，具有该酶活性的AhGLP蛋白能抗氧化胁迫。转基因超表达表明花生AhGLP基因是通过提高整体植株的防卫体系基因的表达而抵御外界病原菌的侵染。综上所述，花生抗黄曲霉侵染是一个复杂的多基因调节的过程。AhGLPs家族是一类同源性差异较大、表达功能多样的调节基因，在调节花生抗黄曲霉等生物胁迫的反应中起到重要作用。