iPS细胞分化的汗腺样细胞复合多孔结构羊皮支架促进创面愈合的机制研究

Skin damage repair, especially the sweat gland regeneration has become the focus and difficulty in the field of medical regeneration.The project will reprogramming of fibroblasts to iPS cells, iPS cells induced by liquid orientation training, make its phenotype into sweat gland cells, and to further explore the extracellular signal regulated kinase (ERK) pathway mechanism.At the same time, this paper using a variety of physical methods, the suede three-dimensional sheepskin scaffolds with porous structure.The sweat gland of iPS cells transfected with GFP grown on porous skin support, to observe the cell growth in the scaffold; in vivo experiment, the induced iPS cells with porous scaffolds were cultured skin biological dressing, transplantation in the treatment of full-thickness skin damage, growth and development to observe its effect on skin wound healing and sweat gland cells, in order to further explore the composite material in the action mechanism to promote wound healing.

皮肤损伤修复，特别是汗腺的再生已经成为再生医学领域研究的重点与难点。本项目将成纤维细胞重编程为iPS细胞，运用培养液定向诱导iPS细胞，使其表型转化为汗腺样细胞，并进一步探讨细胞外信号调节激酶(ERK) 通路的机制。同时，本课题拟运用多种物理方法，将羊皮做成具有多孔结构的三维羊皮支架。将转染GFP的汗腺样iPS细胞种植于多孔羊皮支架上，观察细胞在支架孔隙内的生长情况；在体内试验中，将经过诱导的iPS细胞与多孔羊皮支架生物敷料共培养，移植治疗裸鼠全层皮肤损伤，观察其对皮肤创面愈合的影响及汗腺样细胞的生长发育情况，从而进一步探讨该复合材料在促进创面组织愈合中的作用机制。

在烧伤及严重的皮肤损伤修复中，而受损的皮肤附属器官如皮脂腺、汗腺、毛囊等都不能再生，严重影响患者的生活质量。汗腺细胞在体外培养不增殖，限制了对创面修复的研究。有研究利用BM-MSCs诱导为iSGCs，将其移植到受体患处，可以在损伤部位形成汗腺，且碘发汗实验阳性。但BM-MSCs来源受限，外源性的细胞易发生免疫排斥，而iPS细胞是由成体细胞诱导分化而来的，并且与胚胎干细胞功能相似，具有自我更新并维持未分化状态，具有多向分化潜能。脱细胞真皮基质在创面愈合中具有抗菌、抗炎、促进表皮细胞迁移、改善肉芽组织等作用。本研究旨在利用iPS细胞诱导为iSGCs，将诱导的iSGCs移植到脱细胞羊皮生物敷料敷于创面以期对全层损伤皮肤进行功能修复。本研究成功制备多孔结构的脱细胞羊皮生物敷料，MTT检测其浸提液对细胞生长没有影响。将小鼠成纤维细胞诱导为iPS细胞，免疫荧光检测Sox2、SSEA-1、Oct4、Nanog呈红色阳性染色。诱导实验发现将BM-MSCs诱导为iSGCs的方法不能将iPS细胞诱导为iSGCs。但实验过程中尝试多种方法均不能将其诱导为iSGCs，在这里仍需对汗腺的发生分化及其特异性的机制进行探索研究。为此调整实验计划，利用iPS细胞复合多孔结构脱细胞羊皮生物敷料治疗裸鼠全层损伤创面。动物实验设置四组： Gauze组、psADM组、Hydrogel-psADM组和iPS-psADM组，统计创面愈合率，iPS-psADM组在21天时创面愈合完全，Gauze组在28d时完全愈合，在7d和14d时iPS-psADM组创面愈合速率显著快于Gauze组。Realtime PCR检测Gauze组、psADM组和iPS-psADM组在14d、21d、28d时创面组织中CK18、Vim、Bax、Bcl-2、VEGF、Collagen I和Collagen Ⅲ的mRNA的表达变化，结果显示在iPS-psADM组中CK18、Vim在28d时显著高于Gauze组；Bcl-2/Bax在21d时显著高于Gauze组；VEGF的表达在14d时显著高于Gauze组，Gauze组VEGF表达上调时间滞后；Collagen I在14d和21d表达量显著高于Collagen I；Collagen Ⅲ显著低于Gauze组。Western-blot检测CK18、Vim、VEGF和Collagen I蛋白的表达