强直性肌营养不良基因分析及氯离子通道靶向调节研究

Abstract：Myotonic dystrophies(DM) are autosomal dominant disorders characterrized by myotonia, muscle weakness, muscle wasting, and other variably associated multisystemic manifestations.The molecular mechanisms of the DM is that CLC-1 chloride channel dysfunction secondary to a shared toxic RNA gain-of-function for non-coding expanded (CUG)n/(CCUG)n transcripts. The results suggest that Carbamazepine and Mexiletine can act indirectly on CLC-1 through a mechanism related to inhibit intracellular sodium concentration, relieve myotonia effectively.Objective:The therapeutic approaches in the DM depend on modification expression and current amplitude of the CLC-1 chloride channel effectively. Contents: To make a definite diagnosis by denaturing-performance liquid chroma tography(DHPLC) and DNA sequencing; to report the characteristics of Chinese DM mutation;to built the cellular models of the DM and investigate the effects of CLC-1 chloride channel in vitro and in vivo; to study the therapeutic approaches including utilization of antisense oligonucleotides and isoquinoline(H-7) to prevent the PKC-mediated phosphorylation of CUGBP1 and the CLC-1 chloride channel dysfunction. Then we will detect the change of mRNA and protein level of CUGBP1/CLC-1 chloride channel by the Real-Time PCR and western-blot technique; detect electric conduction of the CLC-1 chloride channel by the green fluorescent protein(GFP) and patch clamp.This research is to change previous monogenic disease transgenic, exon skipping, protein substitution method，and to promote the transformation from animal models to the clinical application.

强直性肌营养不良（DM）呈AD遗传，以肌强直、肌无力、肌萎缩为主征 ，伴多系统受累。发病机制：核苷酸重复序列异常扩增RNA毒性作用、继发CL-通道功能异常；卡马西平、美西律阻断Na+通道、间接调节CL-通道，可缓解肌强直。设想：靶向干预、调节CLC-1蛋白表达及电流异常，实现有效治疗DM。研究内容：DHPLC、基因测序、获得中国人DM基因变异特点及确诊病例；DM骨骼肌细胞培养、传代，用于调节CL-通道研究；ASOs转染（细胞内）、异喹啉磺酰(H-7)干预（细胞外）两条途径，抑制RNA毒性致PKC过度磷酸化，改善CLC-1蛋白表达与电流幅度；RT-PCR、Western blot检测CUG结合蛋白、CLC-1蛋白mRNA表达，GFP、膜片钳检测CLC-1通道蛋白表达及导电能力。本研究改变既往单基因遗传病转基因、外显子跳跃、蛋白替代等研究方法，缩小动物模型研究转化至临床应用的距离。

强直性肌营养不良呈常染色体显性遗传，以肌强直、肌无力、肌萎缩为主征，伴多系统受累，又称萎缩性肌强直，临床上由于肌强直为突出表现，与非萎缩性肌强直鉴别诊断存在一定困难。卡马西平、美西律可明显缓解肌强直症状。研究内容：1)强直性肌营养不良属于核苷酸重复序列动态突变性疾病，根据致病基因DMPK/Znf9进行分型。Sanger及二代测序均无法检出致病基因核苷酸片段重复的检测，使用优化PCR，建立强直性肌营养不良的分子生物学诊断方法。2) 应用Sanger测序对非萎缩性肌强直进行基因检测，发现本组疾病临床表型相似，直接明确致病基因存在一定难度，外显子捕获二代测序技术的临床应用为本组疾病的分子生物学诊断带来了新的进步。3）卡马西平、美西律治疗肌强直综合征临床疗效评价双盲随机对照研究。重要结果：1）25例DM进行分子生物学诊断过程中，针对实验条件不稳定、条带不清晰等技术问题，优化PCR条件，实现普通PCR技术扩增基因高GC含量区域。2）完成17例非萎缩肌强直样本检测分析，8例CLCN-1变异致病，包含3个已报致病位点，7个新发致病位点；4例SCN4A变异致病，包含 1个已报致病位点，3个新发致病位点。3）临床试验正在进行中，由于个体差异和选药不同，疗效存在较明显的差异。关键数据：1)DM优化后PCR反应条件。循环参数：预变性：95℃，5min；变性：95℃，45s；退火：66℃，8s；延伸：78℃（DMPK）/75℃（Znf9），3min, 30循环；最终延伸：72℃，10min。 2)CLCN-1新发突变位点：c.857T>A，c.1389insT，c.2330delG，c.795A>G，c.1872G>T，c.1679T>C，c.138C>T；SCN4A新发突变位点：c.5468C>G，c.5283G>A，c.4916G>A。 科学意义：1)优化PCR反应，建立了高效、经济和简便强直性肌营养不良的分子生物学诊断方法，可广泛应用于临床诊断及鉴别诊断；2)非萎缩性肌强直综合征临床表现类似，基因检测是诊断的金标准，由于其涉及基因众多，外显子捕获二代测序技术的临床应用为本组疾病的分子生物学诊断带来了新的进步；3)临床试验的结果对于DM患者临床选药具有指导意义。