SMAD4-USP9X环路正反馈调控猪卵巢颗粒细胞中TGF-β信号通路的表观遗传学机制

TGF-β signaling pathway plays an important role in ovarian granulosa cell status, follicular developmental fate and reproductive potential of domestic animals. In our previous studies, SMAD4 (the downstream molecule in the TGF-β pathway) was found as a positive feedback controller for the TGF-β pathway in the porcine ovarian granulosa cells, which could also form a loop with USP9X. Both SMAD4 and USP9X could modulate TGFBR2. Therefore, we speculate that SMAD4-USP9X loop may positively feedback to regulate TGF-β pathway mediated by TGFBR2. Based on the above hypothesis, the mechanism of SMAD4-USP9X loop formation will be analysed by ChIP and Co-IP in porcine ovarian granulosa cells. The overexpression and Co-IP techniques will be used to detect the effect of SMAD4-USP9X loop on the epigenetic mechanism of positive-feedback regulation for TGF-β pathway through the deubiquitination of TGFBR2. The epigenetic mechanism for positive-feedback regulation of TGF-β pathway will be also investigated via the USP9X-SMAD4 axis mediated by miRNA-TGFBR2 using EMSA and ChIP. This study will benefit the improvement for understanding the feedback regulation of TGF-β pathway, and further help to reveal the regulatory mechanism for follicular development and reproductive potential of pig.

TGF-β信号通路是调控家畜卵巢颗粒细胞状态、卵泡发育命运和繁殖潜能的关键通路。前期研究发现在猪卵巢颗粒细胞中，SMAD4（TGF-β通路最后一个成员）可正反馈调控TGF-β通路，并与USP9X形成环路，且两者均可调控TGFBR2，因此我们推测SMAD4-USP9X环路可能通过TGFBR2参与SMAD4对TGF-β通路的反馈调控。基于以上假设，本项目拟采用ChIP和Co-IP等技术分析猪卵巢颗粒细胞中SMAD4-USP9X环路形成机制；采用过表达和Co-IP等技术分析SMAD4-USP9X轴通过影响TGFBR2去泛素化反馈调控TGF-β通路的表观遗传机制；采用EMSA和ChIP等方法分析USP9X-SMAD4轴通过miRNA-TGFBR2反馈调控TGF-β通路的表观遗传机制。研究结果对完善TGF-β通路的反馈调控，深入解析其调控猪卵泡发育机制，和最终阐明猪繁殖潜能的遗传机理等均有一定意义。

TGF-β信号通路是机体内最重要的信号通路之一，也是影响母猪卵泡发育和繁殖力的关键信号通路。在TGF-β信号通路的调控机制中，反馈调控一直是科学家关注的重点。申请人前期利用转录组数据发现核心信号分子SMAD4是猪卵巢颗粒细胞中TGF-β信号通路的新反馈调节因子，并与去泛素化酶USP9X形成环路，且两者均可调控TGF-β信号通路II型受体TGFBR2，因此推测SMAD4-USP9X环路可能通过TGFBR2参与SMAD4对猪卵巢颗粒细胞中TGF-β信号通路的反馈调控，并提出通过分析SMAD4-USP9X环路形成机制及其反馈调控TGF-β信号通路的机制来验证这个假设。结果发现：（1）SMAD4作为转录因子可直接与猪卵巢颗粒细胞中USP9X基因启动子区SBE1基序直接结合，转录激活USP9X，而USP9X作为去泛素化酶可促进猪卵巢颗粒细胞中SMAD4蛋白的去泛素化，进而维持SMAD4蛋白稳定性，揭示了猪卵巢颗粒细胞中SMAD4-USP9X环路的形成机制；（2）TGFBR2蛋白是去泛素化酶USP9X的新潜在底物，后者可抑制TGFBR2蛋白的泛素化，通过蛋白酶体途径调控猪卵巢颗粒细胞中TGFBR2蛋白水平，进而激活TGF-β信号通路和抑制猪卵巢颗粒细胞凋亡，阐明了SMAD4-USP9X轴正反馈调控猪卵巢颗粒细胞中TGF-β信号通路的表观遗传学机制；（3）SMAD4直接结合在目标miRNAs启动子区上，抑制猪卵巢颗粒细胞中miRNAs的表达，从而解除这些miRNAs对靶基因TGFBR2的抑制作用，进而介导去泛素化酶USP9X对TGF-β信号通路活性的激活作用和对卵巢颗粒细胞凋亡的抑制作用，解析了USP9X-SMAD4轴正反馈调控猪卵巢颗粒细胞中TGF-β信号通路的表观遗传学机制。研究结果对完善TGF-β信号通路的反馈调控机制，丰富和拓展TGF-β信号通路调控颗粒细胞功能的表观遗传机制，以及解析猪卵泡发育和闭锁的调控网络，和最终阐明猪繁殖潜能的遗传机理都具有一定意义。