基于体外亲和力成熟平台上的抗VEGF受体2单抗的研究

肿瘤血管靶向药物与肿瘤靶向药物相比，不易产生耐药性。在肿瘤新生血管形成中发挥功能的主要因子是血管内皮生长因子（VEGF），与VEGF 受体2（VEGFR-2）结合发挥促血管增生作用。人VEGFR-2称为KDR，KDR的胞外3区在与VEGF结合信号转导中起关键作用。我们计划以制备的KDR3为靶抗原，从噬菌体展示抗体库中淘选抗KDR的单链抗体（scFv），以串联多种突变方法逐级建立抗体重链突变库进行筛选，生物信息学指导同源建模和分子对接，预测抗体的结构和抗原/抗体复合物优势结构而进行指导突变筛选，构建抗体亲和力成熟的平台，从中获得2~3个优势分子在中国仓鼠细胞（CHO）中表达，利用生物传感器监测抗原/抗体作用的动力学过程，并研究其体外与内皮细胞的结合活性，构建人肿瘤小鼠模型，确定抗体的体内抗肿瘤的活性。本项目的完成将获得自主知识产权的抗血管生成抗肿瘤人源抗体。

本项目以血管内皮生长因子受体2的胞外域KDR3为靶抗原，从噬菌体展示全人源抗体库中淘选抗KDR的单链抗体（scFv），将亲和力最高的优势抗体命名为AK404R，并以多种突变方法逐级建立抗体重链突变库进行筛选，生物信息学指导同源建模和分子对接，预测抗体的结构和抗原/抗体复合物优势结构而进行指导突变筛选，构建抗体亲和力成熟的平台，最终以野生型AK404R为主要研究对象进行深入研究开发。体外抗血管生成活性研究显示AK404R与抗原结合的亲和力常数为nM水平，具有较好的抗血管生成的活性，能显著抑制血管内皮细胞的增殖和迁移。. 进一步，我们将单链抗体的重链和轻链可变区分别与恒定区连接产生H链和L链，与载体连接后共转染中国仓鼠细胞（CHO-S），挑选阳性克隆，建立稳定细胞株，进行1L、3L、5L发酵罐发酵表达抗体Mab-04，并经纯化获得纯度>95%的蛋白。进一步采用BiaCore监测了抗体与抗原结合的动力学过程，抗体与内皮细胞及多种肿瘤细胞细胞膜受体结合呈高的选择性，并能抑制相应细胞的体外增殖。Western Blot显示抗体能选择性抑制VEGFR2及下游信号蛋白的磷酸化，而不影响VEGFR1的磷酸化水平。体内试验中，高剂量组在黑色素瘤黑鼠中能显著抑制肿瘤的生长。总之，该项目研究获得的抗体进一步开发可以用于病理性血管增生相关的疾病，包括部分VEGFR2阳性的肿瘤，目前同类抗体国内外均无产品上市。