循环肿瘤细胞中乙型肝炎病毒X基因整合与突变的研究

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）X 基因（HBx）在肝细胞基因组中的整合和X 蛋白的反式激活作用对于肝癌的发生和发展、转移有重要意义。同时，循环肿瘤细胞（CTC）是近年来肿瘤转移、复发领域研究的热点，大量证据表明，在肝癌患者肝癌切除或肝移植前，已有肿瘤细胞脱落进入血循环系统中，入血的循环肿瘤细胞是导致肝癌术后转移和复发的重要因素。本研究以HBV阳性的肝癌患者CTC为研究对象，应用Alu-PCR的方法，分析研究CTC中HBx基因的整合及突变情况，从而揭示HBx基因的在肝癌患者细胞中的突变及整合特点。并于细胞水平探讨有可能发现的新的HBx基因的生物学功能，比较新的突变性HBx基因与野生型HBx基因促细胞凋亡作用、细胞转化作用的差异。实验结果将进一步阐明肝癌发生、转移的分子机制，为临床治疗提供新的理论基础及实验依据，具有重要意义。

在本项目研究中，我们首先在HepG2.2.15细胞中，检测未整合的HBx基因，及整合的HBx基因的突变情况，结果发现，未整合至染色体的HBx基因，经测序结果与野生型一致。而用Alu-PCR的方法，检测到在HepG2.2.15细胞中，HBx基因整合至第16号染色体上，并且，整合的HBx基因发生C末端缺失，此后这种突变型基因在24例CTC样本中，有3例CTC检出类似的突变型基因。此后，我们分别将野生型及突变型HBx基因克隆至真核表达载体pCMV-Tag2B，稳定转染人正常肝细胞系L-O2后，发现野生型及突变型HBx基因均可上调细胞中miR-125a-5p的转录水平，且突变型HBx基因对于miR-125a-5p的上调更加明显，同时抑制miR-125a-5p的靶基因TNFAIP3/A20的表达。. 在此之上，我们发现无论HBx或是miR-125a的转染，均可增加L-O2细胞对于TRAIL诱导细胞凋亡的敏感性，这种敏感性的增加与A20蛋白表达的抑制相关，同时，HBx激活caspase-8的水解，并且我们发现caspase-8的K63泛素化水平被HBx蛋白所抑制。以上研究结果均提示，突变型HBx基因、miR-125a及A20均有可能成为HBV感染过程中的关键诊断标志物，并有可能作为HBV感染相关治疗的潜在的治疗靶点。