TGFβ/Smad3介导miR-140调控ADAMTS-5表达在OA早期软骨降解中的作用研究

Osteoarthritis (OA) is a degenerative joint disorder. OA incidence increased year by year with the aging of population. But the mechanism of OA is still not clear. Recent reports and our previous study reveal that TGFβ, microRNA and ADAMTS play the main roles in OA, while the studies about the relationship among them were rarely seen. By using SD rats, our study will do mechanism study in vivo and in vitro about miR-140 regulated by its upstream signaling TGFβ/Smad3, and detect the relationship between the expression of ADAMTS (downstream target gene of miR-140) and cartilage degeneration, through bioinformatics, gene expression stimulating and inhibiting, RT-PCR, western-blot, light microscope, electron microscope, etc. This study may reveal an important regulation pathway of the expression of ADAMTS in vivo, and provide new method and experimental basis for target regulation in OA therapy.

骨关节炎（OA）是一种以关节软骨渐进性破坏为主要病理特征的关节病损。随着人口老龄化的加剧以及预期寿命的延长，OA的发病率逐年增加，但其发病机制目前仍然不清。国内外研究及我们的前期研究结果显示转化生长因子（TGFβ）、微小RNA（microRNA）及解整连蛋白金属蛋白酶（ADAMTS）在OA 早期病变中发挥着重要的作用，但目前关于三者之间的相关关系及调控机制研究较少。本研究以SD大鼠为研究对象，应用生物信息学、基因过表达及基因抑制、RT-PCR、western-blot、光镜、电镜等检查手段相结合，通过体内体外实验，观察miR-140的上游调控通路TGFβ/Smad3对其表达的调控作用，同期检测miR-140的下游靶基因ADAMTS的表达水平及软骨组织的退变情况。旨在明确ADAMTS在体内表达调控的重要途径，为研究OA发病机制提供新的思路，为寻找OA治疗干预的新靶点提供实验依据。

目的:作为最重要的蛋白质降解酶之一，ADAMTS-5在调节软骨稳态中发挥重要作用，而miRNA-140在软骨中特异性表达，可以抑制ADAMTS-5的表达，延缓骨关节炎的进展。Smad3是TGF-β信号通路中的关键蛋白，miRNA-140的表达在转录和转录后水平受到抑制。有研究表明，Smad3表达的增加与膝关节软骨退行性变和丧失有关，但Smad3是否能介导miRNA-140的表达来调节ADAMTS-5尚不清楚。.方法:体外提取SD大鼠软骨细胞，IL-1β诱导后分别用Smad3抑制剂(SIS3)和miRNA-140模拟物处理。分别在处理后24、48和72 h检测ADAMTS-5蛋白和基因水平的表达。采用传统的Hulth体外方法建立SD大鼠OA模型，分别于术后2周和6周经关节腔注射装有SIS3或miRNA-140模拟物的慢病毒。12周时观察miRNA-140和ADAMTS-5在膝关节软骨组织中的蛋白和基因表达水平。同时，膝关节标本固定，脱钙，石蜡包埋，免疫组化，Safranin O/Fast Green染色，并对ADAMTS-5和Smad3进行HE染色分析。.结果:体外实验中，SIS3组ADAMTS-5蛋白及mRNA在各时间点的表达均有不同程度的下降。同时，SIS3组miRNA-140表达显著升高，miRNA-140模拟物组ADAMTS-5表达也显著下调(P < 0.05);在体内OA模型,发现ADAMTS-5蛋白质和基因表达下调不同程度SIS3和microrna - 140模拟组在三个时间点,和最重要的减少在早期阶段(2周)(P < 0.05),和microrna的表达- 140 SIS3组显著调节,与体外检测到的变化相似。免疫组化结果显示，与空白组相比，SIS3和miRNA-140组ADAMTS-5蛋白的表达显著下调，这也验证了SIS3对Smad3表达的抑制作用。与空白组相比，Smad3的表达明显受到抑制。苏木精和伊红染色结果显示，模拟SIS3和miRNA-140组软骨早期结构无明显变性。Safranin O/Fast Green染色结果相同，软骨细胞数量未明显减少，潮线完整;SIS3和miRNA-140组的Mankin评分结果明显低于其他组。. 本次研究为治疗骨关节炎提供新的方向，也为临床上治疗骨关节炎提供了理论依据。