miR-140调控MMP-3表达在骨关节炎发病中的机制研究

The key pathophysiological features of osteoarthritis(OA) joints include gradually degeneration of the articular cartilage.With the aggravation of aged population，incidence of OA is increasing year by year，nevertheless，it is still no clear that the pathogenesy of OA.In Domestic and international research and our previous work, we demonstrated that matrix metalloproteinase（MMP-3）and microRNA（miR-140） play the key Pathological effects in Etiology of OA. So far, study on expression and regulation of mmp-3 especial from micro-RNA aspect is seldom seen. In this study, we used SD rats to study the expression in vivo and in vitro, and regulation of MMP-3 by using bioinformatics, gene transfection,gene over-expression and gene suppression, RT-PCR, western-blot,ELISA and other molecular biological technology. From Endogenous microRNA regulation model that acting on target genes MMP-3, down-regulate or up-regulate miR-140 to analyze their roles in the regulation of MMP-3 gene expression. Our study may provide theoretical basis and new perspective for the prevention and therapeutic strategies for osteoarthritis through targeting regulation of MMP-3.

骨关节炎（OA）是一种以关节软骨渐进性破坏为主要病理特征的慢性关节病变，随着人口老龄化的加剧其发病率逐年增加，但发病机制仍然不清，国内外研究及我们的初期研究结果发现在OA发病中基质金属蛋白酶（MMP-3）和微小RNA（microRNA）发挥着重要的作用，但目前关于二者之间的相关关系及调控机制研究较少。本研究以SD大鼠为研究对象，应用生物信息学、基因过表达及基因抑制、RT-PCR、western-blot、ELISA、FRET能量转移技术等分子生物技术相结合，通过体内、体外两部分实验，从MMP-3的一种重要的内源性调控模式即miR-140对靶基因MMP-3的调控方面着手，通过上调和抑制miR-140来分析验证其对MMP-3表达的调控作用，旨在明确MMP-3在体内表达调控的重要途径，为研究OA发病机制提供新的思路，为寻找OA治疗干预的新靶点提供实验依据。

本项目通过研究OA病变过程中microRNA是否对软骨细胞表达MMP-3主要调控作用，明确MMP-3是否为miR-140/27b的直接靶基因，确定过表达miR-140/27b是否可下调MMP-3的水平，从而改善OA病变中的软骨降解过程。. 课题组构建了SD大鼠OA模型，在4/8/12周后对OA模型软骨组织和滑膜组织中miR-140/27b和MMP-3 基因以及MMP-3蛋白表达进行了检测及分析，结果显示随着病程的延长，软骨组织表达miR-140、miR-27b水平明显降低，而MMP-3表达逐渐升高，二者之间呈现负相关关系。应用生物信息学软件分析显示rno-miR-27b和rno-miR-140同MMP-3有较强的结合位点，符合本研究进一步实验。. 随后课题组培养了OA软骨细胞，将pre-miR-27b/140、anti-miR-27b/140寡核苷酸、空质粒及生理盐水对软骨细胞进行干预（共培养12小时），然后观察软骨细胞的生长周期、增值存活、凋亡情况及平板克隆情况，结果显示：pre-miR-27b/140可明显促进软骨细胞的增殖，而anti-miR-27b/140可明显抑制软骨细胞的生长及增殖。而通过MMP-3生物传感器FRET技术在活细胞中检测证实，应用pre-miR-27b/140可显著降低软骨细胞表达MMP-3的水平，而anti-miR-27b/140则可提高MMP-3的表达水平。表明miR-27b/140可直接作用于MMP-3的调控，从而对软骨组织的降解起主要作用。.而通过体内试验检测发现，应用pre-miR-140干预后，关节软骨组织中MMP-3 基因和蛋白表达显著降低，软骨mankin评分未见明显变化，而anti-miR-140干预后， MMP-3基因和蛋白表达明显高于对照组，软骨mankin评分显著增高，软骨退变加重。. 通过本次研究，我们明确了MMP-3在体内表达的microRNA调控机制，MMP-3作为miR-140/27b的基因靶点，在OA病变过程中有着极其重要的作用，今后开发出针对MMP-3和miR-140/27b靶向药物，在OA的治疗中有着重要的临床价值。