雨生红球藻向光素介导的虾青素合成信号转导通路的互作蛋白研究

Astaxanthin, a type of high-value ketocarotenoids, is of great commercial interest for its high anti-oxidant activity with a variety of usages. The unicellular green alga Haematococcus pluvialis accumulates astaxanthin, with a level reaching up to 4% dry weight under environmental stress conditions (e.g., high blue light). In our previous study, we found phototropin(PHOT) played an important role in regulating astaxanthin biosynthesis in Haematococcus pluvialis, and we have cloned a novel homologue gene encoding PHOT. But how the blue light signal to be sensed and how this signal initiates key enzyme functions in astaxanthin biosynthesis pathway via PHOT remain still unclear. The interacting proteins with PHOT are also unknown. None of the transcription factors involved in regulating astaxanthin biosynthesis is known. The interactions between interacting proteins and transcript factors become an very important question. For these above questions, this project is going to carry out functional characterizations of PHOT from H. pluvialis. By using yeast two-hybrid system and immune co-precipitation method, the interacting proteins with PHOT will be characterized. Meanwhile gel retardation experiments and bioinformatics were also applied to verify the interactions between interacting proteins and cis-acting elements. Based on the transcription analysis, the signal transduction pathway “Blue light-PHOT- interacting proteins-transcription factor- cis-acting elements- astaxanthin biosynthesis” would be constructed, which may facilitate the sophisticated understanding of the astaxanthin biosynthesis in Haematococcus pluvialis.

虾青素是一种具有极强抗氧化性和广泛应用价值的次生类胡萝卜素。雨生红球藻是理想的天然虾青素生产工具，但虾青素的合成总是发生在不适合生物量积累的逆境胁迫条件下，例如蓝光。申请者前期研究发现蓝光受体向光素在雨生红球藻调控虾青素合成过程中发挥重要的作用，并克隆获得向光素（PHOT）基因序列，但PHOT如何介导虾青素合成途径关键限速酶的转录？PHOT有哪些互作蛋白？下游通路中有哪些转录因子参与虾靑素合成基因的表达调控？互作蛋白如何与转录因子进行相互作用？转录因子如何与顺式作用元件相关作用？这正是本项目拟解决的关键科学问题。本项目拟通过以PHOT为切入点，利用免疫共沉淀和酵母双杂交技术筛选互作蛋白并进行功能验证；以虾青素合成相关顺式作用元件为突破口，利用酵母单杂交技术和凝胶阻滞试验筛选转录因子，并进行活性检测，从而构建“蓝光信号-PHOT-互作蛋白-转录因子-顺式作用元件-虾青素合成”信号转导通路。

虾青素是一种具有极强抗氧化性和广泛应用价值的次生类胡萝卜素。雨生红球藻是理想的天然虾青素生产工具，但虾青素的合成总是发生在不适合生物量积累的逆境胁迫条件下，例如蓝光。课题组前期研究发现蓝光受体向光素在雨生红球藻调控虾青素合成过程中发挥重要的作用，但PHOT如何介导虾青素合成途径关键限速酶的转录？有哪些互作蛋白？下游通路中有哪些转录因子参与虾靑素合成基因的表达调控？互作蛋白如何与转录因子进行相互作用？转录因子如何与顺式作用元件相关作用？针对上述问题，本项目采用多种手段从蓝光受体PHOT和虾青素合成关键酶基因顺式作用元件两端入手，深入研究雨生红球藻感知蓝光信号并调控虾青素积累的信号转导通路与作用分子机制，取得主要结论如下：1）明确了雨生红球藻对蓝光诱导的响应模式，阐明了雨生红球藻HpPHOT的表达特性、光化学特征及在莱茵衣藻、烟草和拟南芥蓝光响应中的生物学功能，暗示HpPHOT在不同植物蓝光响应中功能的保守性；2）筛选鉴定了三个与HpPHOT互作的蛋白（子伴侣HpDnaJ、蛋白激酶HpCDPK及转录因子HpMADS），基因共表达网络分析发现，上述三个基因与HpPHOT可能共同调控虾青素合成关键酶基因（CrtR和BKT）的转录表达；3）基于雨生红球藻胁迫条件诱导下的转录组数据，预测了332个转录因子，并对差异表达的9个候选转录因子（AP2、bHLH、bZIP、ERF、G2-like、HSF、Whirly、WRKY和HB1）进行了序列分析、结合位点预测及表达研究；4）评估了其它类型光受体视紫红质（HpChR1和HpHKR2）和隐花色素（HpCRY4）的序列特征、表达模式、互作蛋白及生物学功能。通过本项目的实施取得成果如下：发表国家基金标注的论文17篇（其中SCI论文14篇，JCR二区及以上9篇）；申请专利6项（授权发明专利4项）；指导博士生6名（毕业2名）、指导硕士生9名（毕业6名）；组织制定虾青素旋光异构体含量的测定液相色谱法国家标准1项；初步构建了以蓝光受体PHOT为桥梁的信号转导通路：1）“蓝光信号→PHOT→MADS转录因子→顺式作用元件→虾青素合成”和2）“蓝光信号→PHOT→DnaJ/CDPK→HpHB1/HpERF等转录因子→顺式作用元件→虾青素合成”的信号转导通路，为全面阐明光诱导雨生红球藻合成虾青素的转录调控机制奠定了科学基础。