猪繁殖与呼吸综合征病毒转录调控序列（TRS）顺式作用元件的鉴定及其在基因转录表达中的机制解析

Transcriptional regulatory sequence (TRS) plays an important role in subgenomic mRNA (sg mRNA) synthesis of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV). But the cis-acting element and regulatory mechanism is largely unknown. The function of the key primary nucleotides and the influence of foreign genes in PRRSV transcription process was identified in our previous research. In this study, firstly, the composition of TRS cassette would be identified through interactions with viral RNA dependent RNA polymerase (RdRp) and the secondary structure detection. After that, in order to define the flanking sequences and secondary structure of TRS cassettes which function in maintaining genetic stability of gene expression, based on a series of PRRSV reverse genetic platforms, foreign report genes would be inserted in PRRSV intergenic region and the expressions are guided by extra inserted TRS cassette. The expression activities are verified and viral characteristics are analyzed, combining with the detection for secondary structure of TRS cassette. This research will be very important for dissection of the viral replication and transcription processes, searching for the anti-viral targets, innovation and development of novel genomic engineering marker vaccine.

猪繁殖与呼吸综合征病毒的转录调控序列 (TRS) 在病毒亚基因组mRNA的不连续性转录过程中发挥重要的调控作用。但对其顺式作用元件组成及作用机制知之甚少！前期研究鉴定了构成TRS的核苷酸残基在转录中的功能及外源序列对PRRSV转录的影响。本研究首先通过与病毒RNA依赖的RNA聚合酶 (RdRp) 结合、二级结构的测定等初步鉴定TRS 的顺式作用元件组成 (TRS cassette)。然后基于一系列的PRRSV反向遗传操作平台，利用鉴定的TRS cassette调控外源报告基因在病毒的基因组开放阅读框(ORF)间区表达。通过报告基因表达活性的检测比较和病毒学特性分析，结合RNA二级结构的测定，确定TRS调控基因稳定表达的cassette中的重要顺式作用元件及其调控机制。本研究为深入理解病毒复制转录的生命活动过程，寻找抗病毒靶标和研发新型基因工程标识疫苗奠定理论基础。

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）采用非连续性转录的机制形成一系列的5’和3’共末端的亚基因组mRNA，用以翻译结构蛋白。这些亚基因组mRNA（sg mRNA）在结构上是多顺反子，在功能上则是单顺反子。PRRSV的转录调控序列（TRS）在sg mRNA的合成中起着至关重要的作用。本项目为了深入了解TRS在病毒亚基因组转录和翻译过程中的作用，做了如下的研究工作：（一）基于PRRSV感染性克隆的反向遗传操作平台，完成了PRRSV-2和PRRSV-1的TRS的鉴定，构建了一系列针对Body-TRS的突变克隆。研究显示同时突变TRS6核心寡核苷酸3’端两个碱基或同时缺失两端侧翼序列的全长突变体克隆不能拯救出病毒，侧翼序列单独缺失不影响病毒拯救，但突变病毒与亲本病毒相比滴度有所下降；（二）将表达pHuN4-F112-EGFP的TRS6替换为TRS2、3、7均可以拯救出病毒，并有相似的生长特性，但含有TRS2的重组病毒滴度相对较低，而将TRS6替换为TRS4或TRS5后，无法拯救出病毒。通过二级结构预测分析发现TRS cassette核心寡核苷酸在茎环结构的相对位置对TRS发挥调控作用有巨大影响。（三）利用反向遗传操作技术，PRRSV也可以被用作外源基因表达的活载体。将猪瘟病毒E2蛋白的编码基因插入了高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112的非结构蛋白和结构蛋白编码间区，所拯救的重组病毒rPRRSV-E2能够在体外和体内高效表达E2蛋白。能够为猪瘟和HP-PRRS的感染提供100%的免疫保护，具有极大的经济价值。（四）利用rPRRSV-E2的全长感染性克隆平台，在PRRSV基因组ORF7和3非翻译区之间插入了TRS6和绿色荧光蛋白的编码基因，构建并拯救了重组病毒rPRRSV-E2-EGFP，该病毒感染MARC-145细胞后，可以同时表达猪瘟E2蛋白和EGFP。外源序列在载体中能够保持遗传稳定。该研究为开发PRRSV作为病毒活载体疫苗提供了一个新的外源基因插入位点和构建策略，对今后多价疫苗的研发有重要意义。