多元酚HBs228衍生物降低HBsAg水平及打破抗原特异性免疫耐受研究

The excessive circulating Hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) is a key factor causing depletion of specific T cell and chronicity in hepatitis B. Recently, we found the HBs228-A, one of the metabolites of a natural polyphenol, can effectively reduce the levels of supernatant HBsAg and HBV DNA in cell cultures of HepAD28 by screening a natural small molecule library which includes approximately 3200 varieties. In the present study, based on the cell cultures with stable HBV replication, HBV infection or HBV DNA transfection, we plan to explore the mechanisms of HBs228 derivatives inhibiting HBsAg and HBV DNA, as well as potential impact caused by the HBs mutations. Furthermore, using the model of HLA-A2 Tg C57BL/6 mice infected with AAV-HBV1.3, we will evaluate the effect of HBs228 inhibiting HBsAg and HBV DNA, and the break of immune tolerance in the mice treated by HBs228 alone or combined with nucleotide analog/TLR9 agonist. Focusing on HBs228 derivatives which are the metabolites from natural medicinal plants in vivo, this project does not only illustrate the anti-HBV mechanism of HBs228, but also aims at developing a promising agent for chronic hepatitis B therapeutics.

循环中大量过剩乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）导致的特异性免疫细胞耗竭是乙肝慢性化的重要机制。既往通过对约3200个天然小分子化合物库的筛选，我们发现一天然多元酚化合物的体内代谢物之一HBs228-A处理HepAD38细胞可有效降低培养上清中HBsAg和HBV DNA水平。在本研究中，利用支持HBV稳定复制、感染或转染的多种细胞模型，我们将进一步研究HBs228系列代谢衍生物对HBsAg及HBV DNA抑制效应和作用机制，并观察HBs突变对其药效的影响。此外，利用腺相关病毒AAV-HBV1.3感染HLA-A2 Tg C57BL/6小鼠模型，评估HBs228衍生物单独或联合应用核苷类似物/TLR9激动剂在小鼠模型中打破免疫耐受及实现病毒清除的能力。基于HBs228为小分子天然化合物在体内的代谢形式，本研究将不仅阐明其抗HBV机制及打破免疫耐受的能力，并有望研发一有应用前景慢乙肝治疗药物。

背景：尽管近年已经发展了多种可高效抑制HBV复制的核苷（酸）类药物，大多数慢乙肝患者需长期用药且停药后反弹。其抗HBV特异性细胞免疫功能没有恢复是治疗失败的关键原因，其中大量过剩HBsAg导致特异性免疫细胞耗竭是重要环节。本研究主要基于既往筛选到能抑制HBsAg水平的HBs228小分子开展研究。主要研究内容及结果：（1）、评价了HBs228系列衍生物在HepAD38细胞模型中的抑制HBsAg及HBV DNA的药效学指标。在HBs228系列衍生物UA,UB和UD中，其中UA有最好的生物学活性，其抑制HBsAg分泌的半数浓度为5 µg/mL。发现青蒿琥珀酯亦有较高的抑制HBsAg的活性，而药物C30对HBeAg具有显著抑制。这些药物在HepDE19、HepG2.2.15、HepG2-NTCP细胞HBV感染模型中也取得了类似结果。（2）、采用PAAV-HBV1.3注射的C57BL/6小鼠建立HBV复制动物模型，并对HBs228的4个衍生物进行降低HBsAg药效的测试，发现HBs228-UA 30 µg/只2个月可下降小鼠血清中HBsAg水平约60%。但进一步延长处理时间，或者加大剂量至60 µg/只则小鼠表现出药物毒性反应。（3）、采用酶联免疫斑点分析（Elispot）分析pAAV-HBV复制小鼠脾脏淋巴细胞在HBsAg多肽表位刺激后IFN-γ的分泌能力，显示不同药物浓度处理组，免疫细胞IFN-γ分泌能力无显著变化。（4）、构建了系列Anti-HBs-CD3双特异性抗体，体外表达纯化测试其与肝细胞中HBsAg及免疫细胞CD3分子结合能力，目前其特异性启动抗HBsAg细胞免疫应答能力尚在研究中。主要发现和科学意义：（1）、HBs228衍生物等小分子药物可以通过HBV生活周期的不同环节抑制病毒的复制和蛋白表达。（2）、药物在动物体内下降HBsAg，但其下调及激活抗HBsAg细胞免疫存在效应瓶颈。（3）绕开耗竭的免疫细胞，直接激活抗HBV免疫可能是更为有效的功能性治愈策略。