E4ORF1促进白色脂肪细胞棕色化的作用和机制研究

Human adenovirus type 36 (Ad36) can induce obesity in humans and animals. Our previous results showed that: Ad36 not only can induce differentiation of human adipose-derived stem cells (hADSCs) into white and brown adipocytes, but also can induce white fat browning; the in vitro experiments showed that Ad36 E4ORF1 polypeptide could promote the expression of brown adipose marker genes such as Ucp1 and Prdm16, and increase the number of mitochondria. By using E4ORF1 recombinants, we also confirmed E4ORF1 can induce WACs trans-differentiate into BACs through mouse morphological experiments. These results suggest that E4ORF1 can promote white adipocytes browning and E4ORF1 could be used as a drug for anti-obesity, but the mechanism is not clear. By using cell and animal models this project intends to use AAV-Ad36E4ORF1 recombinant vector, in vitro polypeptide preparation, in vivo imaging experiments and other strategies to explore the molecular mechanism of E4ORF1 improve glucose or lipid metabolism and promote white fat browning, and evaluate the potential of E4ORF1 polypeptide using as a treatment. The implementation of this project can provide new theoretical and experimental evidence clues for clinical prevention and treatment of obesity.

人类腺病毒36型（Ad36）可引起人类和动物肥胖，我们前期发现：Ad36不但能够诱导人脂肪源性干细胞（hADSCs）分化为白色和棕色脂肪细胞，并能够使肥胖小鼠的白色脂肪呈现棕色化特征；体外实验提示Ad36的E4ORF1多肽可促进Ucp1和Prdm16等棕色脂肪标志基因表达显著上调，线粒体数量增多；我们利用E4ORF1重组体，也初步从小鼠形态学变化证实了E4ORF1促脂肪组织棕色化作用。上述结果提示了E4ORF1具有促进脂肪细胞棕色化的功能和抗肥胖的可能性，然而E4ORF1促进白色脂肪棕色化的机制并不清楚。本项目拟采用AAV-Ad36E4ORF1重组体处理细胞、体外多肽制备、活体成像实验等策略，利用细胞和动物模型，探究E4ORF1改善糖脂代谢并促进白色脂肪棕色化的分子机制，并评价E4ORF1多肽用于肥胖治疗的可能性，本项目的实施可为肥胖的临床防治提供新的理论、实验证据和研发线索。

Ad36感染引起人类和动物肥胖，但与高脂饮食引起的肥胖相比，糖脂代谢指标和胰岛素抵抗水平均显著不同，然而具体分子机制不清。本项目利用Ad36感染脂肪细胞，检测棕色脂肪标记基因和线粒体氧化磷酸化相关基因表达变化，探索Ad36在白色脂肪棕色化中的作用；选取Ad36的关键功能基因E4ORF1，表达并纯化E4ORF1蛋白后，免疫动物制备多克隆抗体；构建AAV-Ad36E4orf1载体，在3T3-L1前脂肪细胞过表达E4ORF1，并用雷帕霉素处理，检测棕色化标记基因、PI3K信号通路基因和细胞摄取葡萄糖水平的变化；构建FLAG-E4ORF1-pcDNA3.1真核表达载体，PDZ结构域、N端和C端缺失的真核表达载体，分别转染3T3-L1前脂肪细胞，探索E4ORF1发挥功能的关键部位；利用免疫荧光和核质分离确定E4ORF1亚细胞定位，质谱分析技术初筛与E4ORF1结合的蛋白质并通过Co-IP实验验证；最后ChIP实验检测E4ORF1是否与糖酵解关键酶Hk2基因启动子区结合，深入探索E4ORF1促进白色脂肪细胞棕色化的作用和机制。研究结果显示，Ad36使3T3-L1脂肪细胞棕色化标记基因上调而细胞内脂滴变小，而mTORC1抑制剂雷帕霉素可抑制上述改变。Ad36关键基因E4ORF1过表达后发挥相似作用，其还通过激活PI3K-AKT途径增加脂肪细胞对葡萄糖的摄取能力。E4ORF1增加脂肪细胞葡糖糖摄取和利用的功能不依赖于PDZ结构域，而是通过其N端和C端结构发挥作用。免疫荧光、核质分离实验结果显示，E4ORF1主要分布于细胞核内；质谱联合Co-IP和ChIP实验证明E4ORF1与SMARCC1蛋白结合形成转录复合物，并与Hk2基因启动子区结合而增加其转录，提高脂肪细胞对葡萄糖的摄取和利用。本课题明确了E4ORF1促进3T3-L1脂肪细胞向BACs分化的功能；揭示了E4ORF1促进白色脂肪棕色化和增加脂肪细胞糖脂代谢能力的分子机制，为后续可能的临床转化应用提供理论依据。