甘草多糖GPS-1的化学结构及对鸡树突状细胞功能调控的机理研究

Dendritic cells (DCs), the important immune cells in higher animals, can be used as targets to screen the active ingredients from the traditional Chinese medicines (TCM) and help to develop new effective and safe veterinary immune-stimulants. Previous study indicated that the glycyrrhiza polysaccharide precipitated by 50% alcohol had immune-modulation effects on chicken bone marrow dendritic cells (chBM-DCs), which might have relationships with TLRs pathway. Moreover, an active glycyrrhiza polysaccharide (GPS-1) was obtained from this part by repeated isolation and purification methods, which could improve the proliferation of immature chBM-DCs, but its chemical structure and modulating mechanism on the cells were still unknown. To elucidate the chemical structure of GPS-1, experiments will be performed by the methods of spectroscopy, chromatography and chemical derivatization. Then the immune-modulatory effects of GPS-1 on chicken dendritic cells in vitro and in vivo will be studied by pharmacological and immunological methods. At last, basing on the TLRs pathway, the modulation mechanism of GPS-1 on chicken DCs will be done by molecular biological and immunological methods. The above experiments can provide suggestions on the exploration of immunological effects and mechanisms of polysaccharides from TCM. This study can not only provide the basis for the comprehensive utilization of glycyrrhiza polysaccharides and the reasonable exploitation of licorice resources, but also have important significance and practical value for the development of polysaccharide immune-stimulants with independent intellectual property rights.

树突状细胞（DCs）是高等动物重要的免疫细胞，以其为靶细胞筛选中药活性成分，有助于研发高效、安全的新型兽用免疫增强剂。前期研究中，申请人发现甘草多糖50%醇沉部分能调控鸡骨髓源树突状细胞（chBM-DCs）的功能，其作用可能与TLRs信号通路相关。通过对该部分进行分离纯化，我们从中获得一种能促进未成熟chBM-DCs增殖的活性多糖（GPS-1），但其化学结构和对该细胞的调控机理尚不清楚。本项目拟通过波谱学、色谱学和化学衍生化等方法阐明该多糖的化学结构，再利用药理学、免疫学等手段研究GPS-1体内外对鸡树突状细胞的免疫调控作用，最后借助分子生物学和免疫学等手段，基于TLRs信号通路研究该多糖对鸡DCs免疫功能调控的机理，为探索中药多糖免疫作用和机理提供借鉴。本研究不仅能够为甘草多糖的综合利用和甘草中药资源的合理开发提供依据，而且对研制具有自主知识产权的多糖类免疫增强剂具有重要意义和实用价值。

本课题先后从甘草中提取、纯化得到甘草粗多糖GPS-1，经HPGPC、完全酸水解和HPLC测定、全甲基化和1D NMR、2D NMR确定了GPS-1的结构。在通过MTT、ELISA、流式细胞术和激光共聚焦法测定GPS-1对鸡淋巴细胞和树突状细胞的安全浓度、增殖影响、释放细胞因子、吞噬能力和抗原递呈能力的影响。接着通过MTT、ELISA、HE染色和免疫荧光等技术方法研究了GPS-1对鸡的体内免疫调节作用，通过qRT-PCR、Western Blot等方法研究GPS-1对树突状细胞的免疫增强机制，通过ELISA法测定鸡肠道中免疫因子和免疫球蛋白的水平，激光共聚焦测定空肠中CD4+/CD8+T细胞的比例，HE染色，16s DNA等技术研究了GPS-1对鸡肠道免疫和肠道菌群的调节作用，通过自由基清除实验、RAW细胞保护实验和蛋鸡体内实验研究了GPS-1的体内外抗氧化作用，最后研究了甘草中的小分子化合物的结构。研究发现，GPS-1的分子量为23505，其主链是由→4)-α-GalpA-(1→构成的HG型果胶；能显著促进免疫细胞增殖，增强淋巴细胞分泌IL-12、IFN-γ、TNF-α和树突状细胞分泌IL-1β、IL-12、IL-12P70、IFN-γ、TNF-α、NO的能力；口服能提高蛋鸡机体免疫水平，同时改善蛋鸡肠道免疫水平和肠道菌群分布，诱导蛋鸡产生更多的NDV抗体以及IgG 和 IgA表达量水平升高；GPS-1改善了肠道屏障的功能，提高了肠道免疫水平，以及调节肠道微生物组成；提高了树突状细胞IFN-γ、TNF-α和IL-12表达水平，提高了DCs的抗原递呈能力和成熟度。基因转录组学分析提示GPS-1对DCs影响的机制可能是通过细胞表面TLR通路，进一步激活核心区域的PI3K- AKT信号通路，并且通过该信号通路进而影响下游的MAPK，NF-κB，NOD，mTOR和AMPK等多种信号通路；对自由基具有一定的清除能力，能清除DPPH自由基、羟自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基，具有较好的抗氧化效果，GPS对RAW264.7细胞的氧化损伤具有一定的保护作用。体内实验表明，GPS-1能提高罗曼鸡体内T-AOC、GSH-Px、CAT活性和 SOD 含量，降低MDA 的含量，从而提高鸡的体内抗氧化活性；甘草含有黄酮、三萜和二苯乙烯类等多种化合物，跟豆科紫檀属和黄芪属存在亲缘关系。