多糖脂质立方液晶纳米粒佐剂活性及对树突状细胞作用分子机理的研究

In our previous researches, the results of the study found that CHMIs (Chinese herbal medicinal ingredients) encapsulated with liposome can not only improve the solubility of drugs, ease of drug metabolism, but also can enhance the immunoenhancement activity of CHMIs. However, CHMIs liposomes have insufficient stability and permeability so that the application of them must be further improved. While the cubosomes have unique advantages, such as well temperature stability, high internal surface area, similar gel viscosity and so on. Therefore, the polysaccharide adjuvant encapsulated in cubosomes will be more conducive to exert its adjuvant activity. The project, on the basis of our previous researches, will take polysaccharide as the research object. Firstly, polysaccharide cubosomes are prepared with different methods and their characteristics and release characteristics of drug and antigen in vitro will be studied. Secondly, the adjuvant activity polysaccharide cubosomes adjuvant on animal vaccines will be compared and selected. Finally, the function of dendritic cells and on dendritic cell surface TLR, NOD like receptor and effects on its signal transduction pathway related the molecular will be studied by laser scanning confocal microscopy, flow cytometry and electrophoretic mobility to which is in-depth study of polysaccharide cubosomes adjuvant effect on the molecular mechanisms of dendritic cells. The aim is to get a good adjuvant activity of polysaccharide cubosomes adjuvant, and provide theoretical basis for further clinical application of adjuvants.

在前期研究中，发现脂质体包封中药成分不仅可以提高药物的溶解性、缓解性，而且可以提高其免疫增强活性。然而，中药脂质体在稳定性和渗透性等不足，使得其应用需进一步改进。而脂质立方液晶纳米粒具有良好的温度稳定性、内表面积高及类似凝胶的黏度等优点，将多糖包封于脂质立方液晶纳米粒中将更有利于其发挥佐剂活性。本项目拟在前期研究的基础上，选择中药多糖为研究对象，首先，用不同方法制备多糖脂质立方液晶纳米粒，并研究其特征及体外药物和抗原的释放特性；其次，研究多糖脂质立方液晶纳米粒佐剂对动物疫苗的佐剂活性，筛选出最好的多糖脂质立方液晶纳米粒佐剂。最后，采用激光共聚焦、流式细胞仪和电泳迁移率等方法测定其对树突状细胞功能及对其表面TLR、NOD样受体及其信号转导通路相关分子的作用的影响，深入研究其对树突状细胞作用的分子机制。旨在得到佐剂活性好的多糖脂质立方液晶纳米粒佐剂，且为免疫佐剂的进一步临床应用提供理论依据。

在前期研究中，研究结果发现脂质体包封中药成分不仅可以提高药物的溶解性、缓解药物的代谢，而且可以提高中药免疫增强剂的免疫增强活性。然而，中药脂质体在稳定性和渗透性等不足，使得其应用需进一步改进。而脂质立方液晶纳米粒具有良好的温度稳定性、内表面积高及类似凝胶的黏度等独特优点，将多糖佐剂包封于脂质立方液晶纳米粒中将更有利于其发挥佐剂活性。本项目在前期研究的基础上，选择中药多糖为研究对象，研究多糖脂质立方液晶纳米粒的制备方法和工艺，并研究其对禽流感疫苗及猪圆环病毒2型疫苗的佐剂活性及其在树突状细胞功能及其表面天然免疫识别受体Toll受体和NOD样受体的作用的分子机制。. 本项目完全按照计划执行。首先，采用优化了灵芝多糖、黄精多糖、牛膝多糖、白术多糖脂质立方液晶纳米粒的制备条件和制备方法，并对制备出的多糖脂质立方液晶纳米粒的形态、粒径、稳定性及体外释放特征进行了测定，研究结果显示制备的多糖脂质立方液晶纳米粒包封率较高，形态为类圆形立方体或类方形立方结构，脂质立方液晶纳米粒晶型为Pn3m，粒径均一，分散系数较小，稳定性较好。其次，研究了多糖脂质立方液晶纳米粒作为PCV、OVA等抗原的免疫增强剂研究其免疫增强作用，结果发现脂质立方液晶纳米粒作为抗原的佐剂能够显著提高疫苗免疫效果，特别是在提升细胞免疫效果方面具有较好效果。最后，探讨了多糖脂质立方液晶纳米粒佐剂活性作用机理，发现其作为免疫增强剂能显著地提高机体的抗体水平，刺激脾脏CD4+和CD8+ T细胞增殖，促进细胞因子的分泌；有效刺激小鼠淋巴结中DCs的成熟和促进抗原从皮下到淋巴结的转运及小鼠淋巴结中中央记忆细胞和效应记忆细胞的生成；能有效地促进小鼠淋巴结内树突状细胞的成熟，通过NOD样受体通路、PI3K-ATK信号通路、细胞因子互作和白细胞跨内皮迁移作用激活脾脏的免疫反应。本项目研究表明将多糖脂质立方液晶纳米粒具有较好的免疫增强作用，为开发高效、低毒的免疫佐剂提供了研究基础和方法。. 本项目作为第一资助已发表论文10篇，作为第二资助已发表论文10篇，均被SCI论文收录，还有1篇英文在投稿；获得国家授权发明专利2项，申报发明专利1项；参加国内学术会议3次，做会议报告2次，获得会议优秀论文1篇；培养研究生6名。