基于斑马鱼的甲状腺功能干扰物识别模型的建立与应用研究

Establishment and application of a zebrafish model to screen thyroid function disruptors .It has been reported globally that the incidence of thyroid diseases was increasing. It could be related to many kinds of environmental pollutants. As a lower organism model, zebra fish has been used in many research fields. Our group try to establish a new model for screening thyroid disruptors using zebra fish. At first, a gene-modified zebrafish line expressing fluorescent protein in thyroid will be treated by several definite thyroid disruptors separately. Then, thyroid size and the fluorescent density will be observed in real time, as well as the phenotype. mRNA chip will be used to screen expression differentiation in the fish, embryo in situ hybridization, RT-PCR and relative protein level detection will be accomplished to verify the result of mRNA chip. Meanwhile, thyroid hormones level and pathological change of thyroid tissue will be detected. By analyzing the relationship of these characters, sensitive indexes related to thyroid disruption strongly will be chosen. Several different thyroid disruptors will be used to test the model. At last, the GM zebra fish model will be used to screen the thyroid disruption of 4 kinds of perfluorated compounds.

近年来，全球甲状腺疾病呈上升趋势，可能与环境中的甲状腺干扰物增加有关。斑马鱼作为一种新的模式动物应用于越来越多的领域，本研究试图基于斑马鱼建立一种新的甲状腺干扰物的识别模型。本研究将利用已经建立的甲状腺示踪转基因斑马鱼，分别用几种明确的甲状腺干扰物处理转基因鱼，在荧光显微镜下实时观察甲状腺的大小和荧光强度，同时观察斑马鱼的表型改变，通过mRNA芯片检测、辅以全胚胎原位杂交和RT-PCR、结合蛋白质水平分析，筛选共性的分子标志物，同时检测斑马鱼甲状腺相关激素水平，检查甲状腺组织病理学改变。分析几类指标的相关性，筛选出与甲状腺干扰作用相关的敏感指标，并用其他甲状腺干扰物对这一模型进行验证。最后用该模型对4种全氟化合物进行初步的甲状腺干扰作用的识别。

近年来，全球甲状腺疾病呈上升趋势，可能与环境中的甲状腺干扰物增加有关。斑马鱼整体试验检测甲状腺干扰作用能弥补只针对某一单独的作用机制设计的试验的缺陷，被OECD列为高度优先发展项目。本研究首先对甲状腺干扰阳性物进行斑马鱼鱼卵急性毒性试验，设计后续甲状腺干扰试验的剂量并观察斑马鱼鱼卵发育过程中的表型改变，发现有些受试物影响幼鱼的孵出时间、色素、鱼鳔发育。用甲状腺干扰阳性物处理甲状腺示踪的转基因斑马鱼卵，发现10dpf左右幼鱼甲状腺荧光表达发生改变。经检测，阳性受试物作用下幼鱼的甲状腺相关激素在均有一定改变，组织病理学改变则不太明显。收集受试物处理的幼鱼，用于转录组测序分析，原计划根据各自的差异基因进行共性分析，然而基于幼鱼整体的测序分析结果显示差异基因数较少，且受试物间几乎没有重合。考虑到本研究所用化合物比较经典，前期的文献数据比较丰富，改变研究方案，选择国际上比较成熟的数据库进行共性基因的筛选。后续研究基于CTD数据库筛选出与甲状腺相关特异性较高的42个基因。基于上述模型，对四种全氟化合物进行甲状腺干扰作用的评价，发现激素水平和甲状腺在体荧光表达水平均有明显改变，数据库比对甲状腺相关基因数据集与各受试物均有交集，这四种物质甲状腺干扰作用筛选结果为阳性。在本研究中以甲状腺荧光示踪的方式在体显示甲状腺组织的状态，能直观体现各种机制导致的甲状腺改变，且与激素水平的变化相吻合。本研究将该模型应用于4种全氟化合物的评价，并检测出其甲状腺干扰作用，可见该模型在化学物的甲状腺干扰作用筛选方面有一定应用前景。