Runx2转录单位的解构及其调控成骨分化机制的研究

近年来非编码RNA的重要性日益彰显。申请人总结前人工作认为：mRNA与其周围/内部多种非编码RNA共同组成基本转录单位（Basic Transcript Unit，BTU）。BTU作用包括两种：一是编码蛋白，由mRNA承担；二是调控基因表达，由多种非编码RNA协同完成。因此基因表达调控应该在BTU的整体水平上进行研究。申请人在前期工作中发现，成骨分化中最关键的转录因子Runx2基因具有BTU的结构，至少包括两种反义非编码RNA：Supt3h与Runx2AS，二者都具有调控Runx2表达的功能。本项目将扩大搜寻Runx2 BTU的其它非编码成员，对BTU成员的序列结构、表达的时空分布进行系统表征，并采用表观遗传技术着重探讨Supt3h与Runx2AS调控作用的分子机制。本项目的完成是对骨分化调控理论的重要补充，可能为BTU功能解析提供一种标准模式，因此极具价值。

骨发生包括骨组织形成（bone formation）和骨组织吸收（bone resorption）两个基本过程。骨形成后，人的一生均通过骨形成和骨吸收构成的骨重建过程保持骨的更新。其中，骨形成由成骨细胞调控，骨吸收则由破骨细胞调控。骨代谢稳态依赖于这两种细胞之间的耦联平衡和精确调控，此平衡一旦被打破，将会导致以骨质疏松为代表的多种骨代谢疾病的发生。.申请人在前期工作中发现，成骨分化中最关键的转录因子Runx2基因具有BTU的结构，至少包括两种反义非编码RNA：Supt3h与Runx2AS，都具有调控Runx2表达的功能。本项目将扩大搜寻Runx2 BTU的其它成员，对BTU成员的序列结构、表达的时空分布进行系统表征，探讨其与骨损伤修复的关系，并着重探讨Supt3h与Runx2AS调控作用的分子机制。.1..Supt3h基因敲除导致了小鼠骨质疏松的发生.X-射线摄像、小鼠后肢骨长度分析表明，Supt3H基因敲除小鼠骨形态正常；但是骨密度检测发现，Supt3H基因敲除小鼠的骨密度明显低于野生型小鼠（P＜0.01）。Micro-CT分析显示，Supt3H基因敲除小鼠股骨松质骨骨密度和骨矿物含量明显减少（P＜0.01），骨表面积和体积比升高（P＜0.01），骨体积分数下降（P＜0.05），同时骨小梁的数量减少，连接度降低，厚度减小，骨小梁间隙增大，结构形态杆状化，其超微结构发生了退行性变化，出现了明显的骨质疏松的表型。.2..Supt3h基因敲除促进了破骨细胞的分化成熟和骨吸收活性.组织切片TRAP显色表明，Supt3h基因敲除小鼠破骨细胞数目和活性明显增强；体外破骨细胞M-CSF和RANKL诱导分化实验发现，Supt3h基因敲除导致破骨细胞数量显著增多（P＜0.01），体积显著增大（P＜0.01），骨片上骨吸收陷窝多且面积大（P＜0.01）。分子水平检测发现， Supt3h基因敲除小鼠的破骨细胞标志性基因TRAP、CTR和cathepsinK的表达显著升高（分别为P＜0.01、P＜0.05和P＜0.05）。上述结果提示：Supt3h基因敲除促进了破骨细胞的分化成熟和骨吸收活性。对体外诱导培养的破骨细胞在不同的时间点提取蛋白，发现诱导时间5min时，NF-κB信号通路中的IKK、IκB和NF-κB的磷酸化水平达到最高峰，且Supt3h基因敲除组高于野生型组。