microRNAs调控BMP-2诱导间充质干细胞成骨分化机制的研究

microRNA是一类能够调节基因表达的小分子非编码RNA，参与多种细胞功能调控。目前，microRNA成骨分化的关系尚不明了。课题组在前期工作中发现，BMP-2处理间充质干细胞后，八种microRNA的转录水平明显上调，功能研究表明其中miR-32促进成骨分化，而miR-98与miR-26具有抑制作用。还发现miR-32可以靶向抑制骨形态发生蛋白-2信号通路的抑制蛋白Smad6的表达水平。.本项目将应用3'UTR移植技术，针对BMP-2信号通路的23种关键基因进行调控microRNA的快速筛选，扩大成骨相关microRNA（Osteogenesis-related microRNA, Osteo-miRNA）的筛查范围，对其功能进行深入研究。由于目前关于microRNA表达调控的表观遗传学机制的报道十分不足，本项目将围绕BMP-2调控Osteo-miRNA表达的分子机制展开进一步探索。

差异基因相关 pathway分析表明ErbB途径可被Osx调节，Real-time PCR结果揭示这是一种通过下调配体Hbegf等表达实现的负调控作用。Real-time PCR结果说明过表达Hbegf可抑制Osx诱导的成骨早期分化（抑制Alp表达）；Real-time PCR及ALP活性分析(碱性磷酸酶染色)结果表明重组人 HB-EGF（rHB-EGF 20ng/ml）处理C2C12/OsxDox也可抑制成骨早期分化（抑制Alp表达），说明Hbegf可抑制Osx诱导的成骨早期分化。.Western blot检测结果揭示rHB-EGF (20ng/ml)处理C2C12/OsxDox可引起Egfr，ERK1/2，Akt与JNK磷酸化；AG1428(1μM)，PD98059 (20μM)，SP600125 (10μM)及LY294002 (10μM)分别处理C2C12/OsxDox后进行Western blot检测发现ERK1/2，Akt与JNK以平行方式发生磷酸化，且以Egfr磷酸化为基础。.在线分析(Consite与MatInspector)发现mir-1192启动子上有五个Osx结合位点(Osx-1, Osx-2, Osx-3，Osx-4及Osx-5)，EMSA与ChIP结果证明Osx可与Osx-2及Osx-5结合靶向激活mir-1192；mir-1192模拟物或阻遏物转染C2C12/OsxDox后进行Real-time PCR分析发现mir-1192可促进Osx诱导的成骨分化 (可激活标记基因Alp及OC的表达)，转染mir-1192模拟物后进行的ALP活性分析(碱性磷酸酶染色)结果也说明了这一点。.因此Osx可通过两种方式抑制Hbegf表达：在转录水平，Osx靶向抑制其转录；在翻译水平，Osx靶向激活mir-1192抑制其翻译，最终抑制Hbegf对Egfr，ERK1/2，Akt与JNK的磷酸化，抑制Hivep3与Twist2表达，维持Maf的基础表达，促进成骨分化。