miRNAs介导Runx2调控成骨分化的分子网络解析

近年来全球的骨相关疾病的发病率有不断攀升的趋势,因此研究成骨过程的分子机制对于临床治疗有较大的指导意义。在骨形成过程中，蛋白编码基因与小分子RNA相互调控，构成一个十分复杂的调控网络，共同决定了干细胞的分化方向。Runx2作为成骨过程中最关键的一个转录因子，在其中起到决定性作用。前期研究中，我们通过Tet-on表达系统实现了Runx2在成肌干细胞C2C12中的稳定可调控表达，通过高通量的筛选方法找到20余种接受Runx2的调控并能够介导Runx2的促成骨分化作用的miRNAs，记作OsteomiRs。.本研究将结合蛋白组学、基因芯片与基本分子生物学技术，对候选OsteomiRs作用的靶基因进行全面鉴定与功能验证；通过表观遗传学方法系统研究Runx2调控候选OsteomiRs启动子的分子机制。本项目的完成将是第一次全面深入揭示成骨过程中，蛋白-miRNA调控网络的组成与相互关系。

在C2C12，MC3T3-E1及C3H10T1/2中稳定过表达Runx2后进行的ALP活性分析结果揭示Runx2在C2C12中促成骨分化能力最强，并利用Tet-on advanced基因表达系统在C2C12中分两步建立C2C12/Runx2Dox。.靶基因在线预测 (DIANA.microT, miRWalk与miRDB)发现mir-690在Rela/p65 3’UTR存在三个结合位点；Real-time PCR及Western blot检测结果表明Runx2对Rela/p65的转录无调节作用，但可抑制其在蛋白水平的表达。mir-690模拟物转染C2C12/Runx2Dox后进行Real-time PCR及Western blot分析发现mir-690可抑制Rela/p65翻译而不降解其mRNA；mir-690模拟物与psiCHECKTM-2-Rela/p65 3’UTR载体共转染C2C12/Runx2Dox后检测luciferase活性发现mir-690可抑制海肾荧光素酶表达，表明mir-690可靶向抑制Rela/p65翻译。Real-time PCR结果揭示过表达Rela/p65可抑制Runx2诱导的成骨分化 (抑制Alp及OC表达)。结果说明mir-690可靶向抑制Rela/p65翻译，促进成骨分化。.Real-time PCR结果揭示：Rela/p65过表达可靶向激活IL-6；Runx2过表达可抑制IL-6； IL-6过表达可抑制Runx2诱导的成骨晚期分化 (抑制OC表达)，但对早期分化没有影响(对Alp无影响)。结果说明Rela/p65靶向激活IL-6以抑制Runx2诱导的晚期成骨分化。