阳离子基因载体的pH敏感遮蔽材料及评价方法的构建

Researchers made great progress on cationic gene carriers. But the lack of stability and intelligent of gene carrier/DNA polyplexes make it hard to be systemic delivery in tissue. In this project, we graft sulfa derivatives with different pKas to PEG-PLL main chain to produce a kind of shielding system, which contains PEG segments and shows pH sensitivity and biodegradability. Sulfa derivatives show negtive charges at higher pH and can shield the positive charge of polyplex by electrostatic interaction. The anti-protein property of PEG segments and positive charge shielding can both reduce the non-specific interaction and prolong the circulation time and stability during blood circulation. Because of the pH sensitivity of sulfa derivative, the shielding system can protect the polyplexes during the cycle in normal body fluid (pH=7.4) and release it when arrive the acidic tumor tissue (pH<6.8). This intelligent shielding/de-shielding process not only improves the stability of polyplexes but also promotes the cellular uptake of polyplexes in tumor tissues. The most persuasive way of pH sensitivity characterization of these shielding systems is in vivo studies. But highly requirement demanding of in vivo studies made it hard to be carried out and popularized. This project explores to construct novel in vitro tests by online change of medium pH to characterize the pH sensitivity of shielding system. By this in vitro trest we can forecast the activity and effect of pH sensitive shielding system when used in vivo.

阳离子聚合物基因载体的研究已取得很大进展，但其综合性能距体内应用还有很大差距，载体/DNA复合物在体内缺乏稳定性和智能性是瓶颈问题之一。本项目将不同pKa的磺胺衍生物接枝到PEG-PLL上，制备一类含PEG链段、pH敏感且可生物降解的材料用以对载体/DNA复合物进行遮蔽。该遮蔽材料通过对复合物正电荷的有效遮蔽和PEG链对蛋白的抗拮作用，有效降低非特异性作用，提复合物在体内循环的稳定性和循环时间；磺胺单元的pH敏感性赋予遮蔽材料"在正常体液中（pH=7.4）对复合物有效遮蔽，到酸性肿瘤组织（pH<6.8）释放出复合物"的智能性。这种智能性保证了循环过程中对复合物的保护，又不影响肿瘤细胞对复合物的摄取。体内试验是评价pH敏感遮蔽的有效方式，但试验条件要求高，难实施，难普及。本项目还通过在线改变培养液pH的方式探索以体外模拟试验代替体内试验，对pH敏感遮蔽材料体内应用性能进行预评价的普适性方法。

如何将基因药物高效转运到病灶部位，是基因治疗临床应用的瓶颈之一。很多体外试验效果突出的阳离子类载体用到体内试验时，效果却很不理想。本项目设计和评价了用作对阳离子基因载体/DNA进行遮蔽的pH敏感材料，以期提高其在体内传输的稳定性：.1、设计合成PEG-PGA(65)，用于对PEI/DNA的遮蔽材料。凝胶阻滞电泳、表面电位和粒径数据表明，PEG-PGA(65)对PEI/DNA具有良好的遮蔽作用。pH=7.4时，PEG-PGA(65)对DNA/PEI的表面正电荷进行部分遮蔽后，转染效率提高1.5倍；完全遮蔽正电荷后，转染效果差；pH=6.0时，不同遮蔽比例下的转染效率基本维持在不加遮蔽的水平。细胞摄取实验显示，pH=6.0条件下细胞对复合物的摄取效率更高。此结果表明复合物表面正电荷的存在，是被细胞摄取的必要条件之一。.2、将磺胺衍生物接枝到PEG-PLL，制备遮蔽材料PPD和PPT。两者都具有良好的pH敏感性和对PEI/DNA的有效遮蔽性。转染实验发现，随PPD和PPT的加入，pH=7.4时转染效率明显下降，而在pH=6.0时，转染效率几乎恢复到遮蔽前状态。不同pH条件下的细胞内吞实验也验证了PPD和PPT的“生理pH时有效遮蔽，酸性肿瘤环境释放复合物”的智能性。.3、设计合成并评价了具有电荷翻转性能的聚合物OEAL（OEI-PBLA-PLL）作为遮蔽材料。体外细胞内吞和转染实验都表明，生理pH下OEAL能有效的遮蔽PEI/pDNA的正电荷，提高其稳定性；低pH下又通过pH触发的电荷翻转作用，能将复合物表面电荷翻转为正电荷，提高细胞内吞和转染。小鼠体内实验表明，OEAL遮蔽后的传输体系能有效抑制肿瘤生长；免疫组学分析显示遮蔽材料对小鼠脏器无损伤。.4、体内试验是评价pH敏感遮蔽的最直接方式，但试验条件要求高普及难。本项目通过在线改变培养液pH的方式模拟体内pH变化，进行多pH条件下内吞和转染实验探索，评价遮蔽体系的性能，取得很好效果。近年的论文中对这种方法有较多报道，是一种对遮蔽体系体外评价的普适性方法。.本项目合成并评价了pH敏感的遮蔽材料。体内外实验表明，这些材料都能在生理环境下稳定阳离子基因传输体系，并在酸性条件下释放载体实现转染。有望通过提这种遮蔽策略，提高复合物稳定性和环境响应性，来帮助突破阳离子基因载体体内应用的瓶颈问题，促进基因治疗的发展。