鲸类黑皮质素4受体(MC4R)基因的克隆、功能分析及与其体型大小的相关性研究

Melanocortin-4 receptor (MC4R) is a G-protein coupled receptor principally expressed in central nervous system and involved in the regulation of feeding, somatic growth, and energy homeostasis. It has been demonstrated that MC4R plays a conserved role in the regulation of energy homeostasis in vertebrate species from teleosts to mammals. Cetaceans exhibit the widest range of body size compared with other animals that live on the earth. However, the molecular mechanism of size control in cetaceans is largely unknown. Since MC4R is important in feeding behavior and energy homeostasis, it may be involved in the regulation of size control in cetaceans. Therefore, we cloned MC4R genes from 21 cetacean species and will analyze the differences in MC4R sequence among these species，and will perform phylogenetic and evolutionary analysis of MC4R in cetaceans. Moreover, we will subclone these 21 MC4R ORFs (open reading frame) into an expression vector, and perform functional studies in vitro to compare their MC4R activity. Furthermore, we will perform mutagenesis of key residues to survey how they control body size and feeding behavior. Based on these evolutionary and functional analyses, we will investigate whether there is a statistical association between MC4R and body size in cetaceans. These results will provide new information about cetacean MC4R, and may provide the impetus to further characterize why cetaceans exhibit an exceptionally wide range of body size. Furthermore, based on this study, we can better understand the evolution of cetaceans.

黑皮质素4受体(MC4R)是中枢神经系统中一个参与调节摄食行为与生长以及能量代谢的重要基因，它被证明在从低等的硬骨鱼到高等的哺乳动物等物种中都发挥着重要的能量调节作用。鲸类是现存动物中体型差异最大的一类动物，虽然其体型大小分化调控的分子机制还尚不清楚，但可以推测控制摄食和能量代谢的基因应起到重要调控作用。因此，本研究将内容聚焦在MC4R基因上，并克隆获得了21种不同鲸类的MC4R基因。我们将分析该基因在不同鲸类中的序列差异，并将分析该基因在鲸类中的进化方式；拟构建不同鲸类MC4R的表达载体并进行体外活性功能分析；将对一些重要的位点进行基因突变及功能活性分析；结合进化和功能分析结果，将MC4R的活性和不同鲸类的体型大小进行回归分析，总结其活性是否与鲸类体型大小相关。本项目将系统地对鲸类的MC4R展开研究，项目的完成或将有助于解释鲸类产生如此大体型差异的分子机制和更好地了解鲸类的进化历史。

鲸类是由陆地哺乳动物完全转为水栖的一支，在其进化过程中，在形态和进食方式等显示出很大的差异。现生鲸类依口内有须还是有齿和摄食方式的不同可划分为2 个亚目: 须鲸亚目和齿鲸亚目。须鲸采取鲸须板滤食的方式，而齿鲸则通过主动捕获吸入或咬食猎物。两个亚目间在形态学上存在较大的差异，而其体型差异是其中一个显著差异。一般来讲，须鲸亚目体巨大，其中蓝鲸是世界上最大的动物，它的体长可达33 米。而齿鲸亚目中除抹香鲸体型比较大之外，多为中小型鲸，记录到最小的海豚之一是赫氏海豚，体长为1.4米左右。黑皮质素4受体(MC4R)是中枢神经系统中一个参与调节摄食行为与生长以及能量代谢的重要基因，它被证明在从低等的硬骨鱼到高等的哺乳动物等物种中的摄食方式和能量代谢平衡中都发挥着重要的调节作用。因此本研究想探索MC4R是否在鲸类的两个亚目中发挥着调节作用。.我们通过克隆获得了20种不同鲸类物种的MC4R 完整编码框序列，通过序列比对和进化选择压力分析，我们发现在鲸类MC4R蛋白的156位点有一个Q/R突变，恰好分别在须鲸和齿鲸两个亚目中发现，须鲸在156位点的氨基酸是谷氨酰胺（Q156），齿鲸在156位点的氨基酸是精氨酸（R156）。通过进一步的对17种鲸类MC4R在哺乳动物细胞系中的表达活性分析，表明这一位点具有精氨酸（R156）能够增强MC4R对激活剂α-MSH的亲和力进一步增强MC4R的活性，且MC4R（R156）具有的固有活性值较MC4R（Q156）更高。须鲸是滤食方式，虽然进食量大，但能量代谢缓慢；而齿鲸多是捕食方式，能量代谢更高。因此，须鲸MC4R（Q156）蛋白的活性低，从而能增加食欲，减少能量代谢；而齿鲸的MC4R（R156）蛋白活性更高，有助于控制食欲，增加能量代谢。因此，我们认为MC4R基因在鲸类摄食、能量代谢平衡和体型调控中起作用的是一个重要的基因。.本项目系统地对鲸类的MC4R展开研究，很好地解释了MC4R对鲸类两个亚目摄食方式和能量代谢的调控作用，也进一步从该角度解释了两个亚目的物种产生如此大体型差异的分子机制。