树突状细胞来源的外泌体诱导特异性肝移植免疫耐受及其机制研究

The complications induced by long-term usage of immunosuppressants have become an important factor causing the death after liver transplantation, it becomes imperative to develop new and specific immunosuppressive agents. Our previous studies found that exosome derived from genetically modified dendritical cells can replace its parental cell to induce specific immune response. In this study we plan to use exosomes to induce specific immune tolerance for liver transplantation. Programmed death ligand 1/programmed death 1(PDL1/PD1) plays an extremely important role in immune tolerance after liver transplantation. The mechanism may be that protein tyrosine phosphatase SHP-1/2 recruited by PDL1/PD1 acts on downstream molecules to alter T cell differentiation from T helper 1 (Th1) cells to regulatory T cells (Treg). Here, at first, exosome was modified to express PDL1 by transfecting dendritical cells with lentivirus and was conferred graft-targeting properties by stimulating parental cell with allogenic antigens. Then the function of modified exosome was evaluated thoroughly in vitro and in mouse models. And the mechanism was explored at last. The study findings will provide new ideas for complications caused by immunosuppressants after liver transplantation.

长期服用非特异性免疫抑制剂引起的并发症已成为肝移植术后死亡的重要因素，因此急需研究新的特异性免疫抑制剂。我们前期的研究发现：对树突状细胞进行基因改造后，其分泌的外泌体可代替树突状细胞有效诱导特异性免疫应答。本项目拟应用外泌体诱导肝移植术后特异性免疫耐受。PDL1/PD1在肝移植免疫耐受的形成中起到极其重要的作用，其机制可能是通过招募蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2，作用于下游分子，减少T细胞向Th1分化，促进其向Treg分化。本研究首先利用免疫抑制蛋白PDL1修饰外泌体，再通过同种异体抗原冲击赋予外泌体抗原特异性，进而对修饰后的外泌体展开系统的体内、外测试，最后初步阐明改造后的外泌体诱导肝移植免疫耐受的机制。本研究将为解决肝移植术后免疫抑制剂引起的并发症提供一种新的思路和途径。

长期服用非特异性免疫抑制剂引起的并发症已成为肝移植术后死亡的重要因素，因此急需研究新的特异性免疫抑制剂。树突状细胞在移植免疫耐受上发挥重要作用，其作用的发挥和表面因子、分泌因子的表达相关。PDL1是诱导免疫耐受的明星分子。本研究是通过基因改造树突状细胞高表达PDL1以诱导肝移植免疫耐受。首先我们通过基因改造获取了高表达PDL1的树突状细胞，研究发现树突状细胞高表达PDL1的同时，其表面共刺激因子CD40、CD80、CD86及组织相容性复合体MHCI、MHCII表达降低，免疫活化因子IL-6、IL-12、TNF-α表达降低，显示高表达PDL1的树突状细胞向免疫抑制的方向转化。进一步用LPS刺激转染的树突状细胞，显示PDL1高表达引起的树突状细胞免疫抑制并不能被强抗原LPS解除。我们建立了多种模型，包括皮肤移植、心脏移植、肝脏移植模型。发现心脏移植模型在存活时间、手术难易度及分子机理等方面最适合药物测试。因此我们在心脏移植模型上对基因改造的树突状细胞进行了系统测试。研究显示：基因改造的树突状细胞及外泌体可减轻对移植物的排斥反应，减少心肌细胞坏死。全身及局部免疫分析显示，基因改造的树突状细胞改善小鼠全身及心脏局部免疫环境，T淋巴细胞浸润减少，调节性T细胞(Treg)浸润增加,显示了基因高表达PDL1对移植物的保护作用。进一步体外纯化T细胞，和DC细胞反应显示，PDL1的转染使TH细胞分化降低，Treg分化增多，揭示了PDL1转染诱导免疫耐受的免疫学机制。在研究中，我们发现树突状细胞的转染和质控是研究的难点，因此我们探索了多种方式对树突状细胞免疫耐受的诱导。发现了一种传统中药中提取的小分子雷公藤甲素能够诱导树突状细胞向免疫抑制方向转化，表现为PDL1表达增加，共刺激因子表达降低，活化因子分泌减少。在自身免疫性疾病模型的测试显示其能够诱导Treg分化，改善免疫环境。这种方法相较于基因改造更简单，可能能在移植术后免疫耐受上发挥作用。因此本研究将为移植术后免疫耐受的诱导和患者停药提供参考。