双靶向抑制MDM2/VEGF药物筛选、生物活性评价及对乳腺癌干预和治疗的机制研究

The applicant has just completed a grant about the regulatory mechanism of VEGF by ubiquitin-protein ligases MDM2, demonstrating that MDM2 in tumor cells increases VEGF mRNA stability and thereby promotes its protein translation. We recently found in breast cancer cells that the binding of VEGF IRES RNA to the C-terminal RING domain of MDM2 also inhibits MDM2 self-ubiquitination and degradation. This grant will study the specific mechanism by which VEGF reversely regulates MDM2, and further try to target MDM2 self-ubiquitination and VEGF translation simultaneously through disrupting their binding. Based on the above concepts, we will develop an innovative fluorescence polarization assay for monitoring MDM2/VEGF binding, and use it in high throughput screening for possible inhibitors from known chemical libraries. Further, the ability of selected agents to kill chemoresistant cancer cells and suppress VEGF-mediated tumor angiogenesis will be determined in vitro and in vivo, which would reversely confirm our theoretical hypothesis. Finally, we will lead pharmacological studies and chemical optimization to assess their potential for clinical use.

申请者前课题已完成MDM2对VEGF调控的研究，证实MDM2可稳定VEGF mRNA并促进其蛋白翻译。近期在乳腺癌中发现VEGF RNA也可通过核糖体进入位点（IRES）与MDM2 C-末端环状结构域结合，抑制MDM2自我泛素化降解。本项目将研究VEGF逆向调控MDM2的机制，尝试干预两者结合，达到①促进MDM2自身泛素化，增加其降解；②降低VEGF IRES活性，干预其翻译，从而双靶向抑制MDM2 和VEGF。我们将建立创新的荧光偏振技术监测MDM2蛋白/VEGF RNA结合/解离情况，并依靠该技术从化合物库中筛选封闭该结合位点的小分子化合物，然后以候选先导化合物为工具，研究其促进MDM2自我泛素化及抑制VEGF蛋白翻译的机制和构效关系，并通过动物模型验证先导化合抗肿瘤生长活性及对瘤体血管生成的抑制，最后我们将通过药理学分析和化学修饰等手段，对先导化合物进行优化使其有进入临床试验的可能。

本项目主要以蛋白质-RNA荧光偏振（FP）技术为基础，从化合物库中筛选针对MDM2/VEGF结合位点的先导化合物，探索VEGF IRES和MDM2蛋白协同互作机制，并尝试对先导化合物进行化学修饰，使之成为潜在的靶向药物。主要研究成果如下：①成功筛选并测试两个化合物，其中一个天然化合物雷公藤内酯表现出对MDM2有抑制作用，且显示良好抗癌活性，机制上发现一个新型MDM2/Akt信号通路，雷公藤内酯可干扰MDM2和转录因子REST之间相互作用，上调PI3K p85的表达，抑制Akt激活，诱导凋亡，并增强多柔比星的细胞毒作用，展示了雷公藤内酯作为抗癌化合物作用机制的新观点。②用小干扰RNA测试了敲减MDM2对乳腺癌细胞中VEGF合成以及裸鼠移植瘤内血管生成的影响，发现siRNA抑制MDM2后，癌细胞分泌VEGF显著减少；下调MDM2使裸鼠移植瘤生长变慢，组织内血管密度明显降低，血清VEGF水平下降。③继续通过FP技术和实验平台高通量筛选其他化合物库，鉴定阻断MDM2蛋白-VEGF RNA互作的几种抑制剂，棉酚和雷公藤就是其中代表，这些化合物诱导MDM2下调不仅导致VEGF抑制，而且使p53持续活化，促进癌细胞凋亡并抑制增殖，且在动物模型中具有非常好的耐受性。本项目贡献了其中大部分实验和数据，筛选药物部分结果发表在Cancer cell杂志上。④测试了另外一个化合物棉酚，通过紫外线交联、RNA结合、泛素化以及等温滴定量热实验，明确棉酚作为MDM2和VEGF的双重抑制剂的作用机制，验证了棉酚对MDM2和VEGF表达、乳腺癌细胞凋亡、肿瘤生长和VEGF介导的血管生成的影响，机制上是通过破坏MDM2蛋白与VEGF mRNA之间的互作，诱导MDM2自我泛素化并降低VEGF翻译，导致细胞凋亡和抗血管生成作用。⑤后期还筛选到一个小分子化合物FKBP12，发现FKBP12与MDM2可互作并诱导MDM2降解，机制研究表明FKBP12通过结合MDM2，干扰MDM2/MDM4互作并诱导MDM2自我泛素化降解，导致p53持续和组成性活化、XIAP抑制和癌细胞对细胞凋亡增敏。