靶向干预MDM2/VEGF信号途径逆转乳腺癌血管生成的实验研究

现已知血管内皮生长因子(VEGF)和癌蛋白MDM2在多数乳腺癌患者的肿瘤细胞中均有过度表达，而它们的高表达与预后较差及化疗不佳关系密切。我们首次于体外观察到乳腺癌细胞在低氧刺激后，核内MDM2可向胞浆移位，且该过程伴有VEGF表达的增高，进而发现在基因重组小鼠胚胎成纤维细胞中MDM2可与VEGF mRNA内部核糖体进入位点(IRES)结合，并促进VEGF蛋白的翻译，但其具体机制以及在乳腺癌发生及血管形成中的作用尚未明了。本课题将在乳腺癌细胞中引入双萤光素酶报告基因，通过蛋白质-核酸紫外交联、GST-pull down及氨基酸代谢标记等实验阐明低氧应激下MDM2与VEGF IRES相互作用介导VEGF翻译的机制及可干预的相关靶点，并以此为基础采用SELEX技术筛选小分子RNA进行阻断，为探索合成新的抗肿瘤血管生成靶向治疗药物，降低化疗抗性，逆转乳腺癌进展提供理论基础及实验依据。

① 本项目主要研究乳腺癌细胞在低氧刺激后，核内MDM2向胞浆移位，促进VEGF表达的增高这个现象背后的机制，经过三年的努力，我们通过引入双萤光素酶报告基因，蛋白质-核酸紫外交联、GST-pull down及氨基酸代谢标记等体外实验证实缺氧状态可促使肿瘤细胞核内MDM2向细胞质转位，细胞质内MDM2可结合VEGF mRNA的3’-UTR，增加VEGF mRNA的稳定性，进而提高肿瘤细胞内VEGF蛋白水平，敲除MDM2后可抑制VEGF的表达。.② 项目实施后期我们通过裸鼠乳腺癌模型实验研究了MDM2特异性小分子抑制剂nutlin-3对VEGF表达及血管生成的作用，并以反义寡核苷酸 (antisense oligonucleotide, ASO) 技术抑制MDM2作为对比，观察到直接干预MDM2表达后抑制血管生成的效果显著优于MDM2-p53途径的经典阻断分子nutlin-3。.③ 除了上述功能实验，我们尝试在人体组织中检测了相关蛋白的表达情况，验证了Gli-1蛋白调控FOXC2可能与基底细胞型乳腺癌的预后有关，取得了预期成果。.④ 在取得阶段性成果及相关实验数据的基础上，我们拓展了思路，研究了一个MDM2重要的调控因子DAXX与它的关系，并发现了其对两个重要的转录因子有直接的调控作用，并尝试运用中药小分子黄连素（BBR）提取物对信号途径进行干预，证实BBR通过结合DAXX启动子结合位点对其转录产生抑制作用，该作用受到SP1和ETS1两个因子的介导。