基于TALEN技术的细胞色素P450基因敲除大鼠模型的构建与应用

Cytochrome P450 gene knockout mouse models are important tools for drug metabolism research and preclinical safety evaluation. But there are two main shortcomings limiting the applications of those models: First, the comparison and integration of the data based on the murine model and the conventional data from rats (including the in vitro test with rat liver microsomes, the PK and toxicity studies on rats) are very difficult. Secondly, mice can only provide small volumes of tissue and body fluids. This fact increases the difficulty of the subsequent pharmacokinetic and toxicological experiments. This project is proposed for the solution of these two difficulties: the cytochrome P450 gene knockout rat models will be generated with the latest TALEN technology. The direct objectives of the project are to build CYP2C11 and CYP2D1 rat gene knockout models, to simulate the human CYP2C9 and CYP2D6 poor metabolizers with those models, and to verify the roles of them in drug metabolism research and pre-clinical safety evaluation. The successful implementation of the project will provide a brand new version of cytochrome P450 gene knockout models, and make those models seamless docking to the conventional drug research and development process.

细胞色素P450基因敲除小鼠模型是药物代谢研究和临床前安全性评价的重要工具。但是有两个主要不足限制了该类模型的应用：一是基于小鼠模型的数据难以与常规的大鼠实验数据（包括基于大鼠肝微粒体的体外试验、基于大鼠的各类毒性试验和药代动力学试验）进行比较和整合；二是小鼠可检测组织体积小，体液容量小，提高了后续药代动力学和毒理实验的难度。本项目提出针对这两个困难的解决办法：利用最新的TALEN技术构建细胞色素P450基因敲除大鼠模型。本项目的直接目标是构建CYP2C11和 CYP2D1两个基因敲除大鼠模型，分别模拟人类CYP2C9和CYP2D6慢代谢型人群，并验证这两个模型在药物代谢研究和临床前安全评价中的作用。项目的成功实施，将是细胞色素P450基因敲除小鼠模型的全新升级，实现P450基因敲除技术与常规药物研发过程的无缝对接。

本项目利用CRISPR/Cas9 基因敲除技术构建CYP2C11和CYP2D1两个基因敲除大鼠模型，并验证了这两个模型在药物安全评价中的作用。项目主要完成研究工作及阶段性成果如下：.1. 与南京大学模型动物研究中心合作成功构建了CYP2C11-null和CYP2D1-null大鼠模型，并完成品系的扩大繁殖与基因型鉴定。.2. 完成对CYP2C11-null和CYP2D1-null两种大鼠模型基础的表型鉴定。.3.使用探针药物甲苯磺丁脲研究了CYP2C11-null和野生型大鼠体内药代动力学以及大鼠肝微粒体体外活性。发现CYP2C11-null大鼠肝微粒体对甲苯磺丁脲的代谢活性显著低于SD大鼠，CYP2C11-null大鼠与野生型大鼠相比在体内代谢无显著性差异。.4.鉴于CYP2C11可能参与EETs代谢调节血压，我们比较了CYP2C11-null和野生型大鼠的基础血压，及其在高盐饮食诱导下血压的变化。初步研究发现CYP2C11-null大鼠血压与SD大鼠血压无显著差异；在高盐诱导下，CYP2C11-null大鼠血压甚至低于SD野生型大鼠。病理组织切片和脏器指数分析结果发现，高盐饮食对两种大鼠肾脏均造成不同程度损伤，但其他主要脏器无明显影响。.5.比较了CYP2C11-null和SD两种大鼠对华法林体内、体外的药物代谢差异，评价了两种大鼠中华法林抗凝血作用。实验结果表明，CYP2C11-null大鼠肝微粒体对华法林的体外代谢活性降低，在体内药动学研究中，CYP2C11-null雄鼠对华法林的吸收速率变慢，清除率降低。在药效学研究中，CYP2C11-null大鼠血浆中华法林抗凝血作用较强，证明了CYP2C11-null大鼠与SD大鼠相比对华法林代谢能力减弱。.6.使用探针药物右美沙芬研究了CYP2D1-null和野生型大鼠体内药代动力学以及大鼠肝微粒体体外活性。研究发现CYP2D1-null大鼠肝微粒体对右美沙芬的代谢活性显著低于SD大鼠。.7.实验结果发现CYP2D1-null大鼠肝微粒体对盐酸文拉法辛的体外代谢活性降低。在药效学研究中，盐酸文拉法辛在CYP2D1-null大鼠中抗抑郁作用较强。.在本基金资助下，课题组在国内外学术期刊发表论文18 篇，其中SCI论文8篇；申请国家发明专利2 项；培养硕士研究生6名。