新型双功能褐藻胶裂解酶特异性制备褐藻胶三糖的催化机制及结构域功能研究

As the focus of marine functional food development, the investigation of alginate lyase on preparation of alginate oligosaccharides has obtained increasing attention. Alginate lyase is an important class of enzyme in food industry, among which the bifunctional one possessed significant value of industrial applications for preparing alginate oligosaccharides due to its wide substrate specificity and high degradation efficiency. This project is aimed to reveal the catalytic mechanism and action mode of a bifunctional alginate lyase AlgS02 in the level of protein molecule and structural domain, which could prepare alginate trisaccharides specifically, by using the methods of structural determination,molecular dynamics, molecular modeling, site-directed mutagenesis and structural domain truncation combined with the utilization of structural biology, bioinformatics, molecular biology and enzymology. The project definitely could enhance the application of the enzyme in preparation of alginate oligosaccharides and provide the theoretical basis for optimization and molecular modification of enzymatic characteristics. So it is definite that there are significant academic and practical in this project.

作为海洋功能食品开发领域研究的热点，褐藻胶裂解酶用以制备褐藻胶寡糖的研究逐渐引起了人们的关注。褐藻胶裂解酶是一类重要的食品用酶，该类酶中的双功能褐藻胶裂解酶由于其底物选择性广泛、降解效率高，在制备褐藻胶寡糖生产中具有重要的工业应用价值。本课题以能够特异性制备褐藻胶三糖的双功能褐藻胶裂解酶AlgS02为研究对象，采用结构生物学、生物信息学和分子生物学以及酶学等多种技术手段，开展酶结构解析与结构域功能验证，通过蛋白结构解析、分子动力学、分子模拟、定点突变和结构域敲除等手段，从酶蛋白分子与结构域水平上阐明褐藻胶裂解酶特异性产生褐藻胶三糖的作用模式及催化机制，为进一步对酶性能优化和分子改造提供理论基础，推进其在制备褐藻胶寡糖产业中的应用，具有重要的学术意义和实用价值。

褐藻胶寡糖由于其具有抗氧化、降血脂等多种生物活性，成为功能食品开发领域的研究热点。不同聚合度的褐藻胶寡糖所具有的生物活性差异很大，因此通过筛选或者改造具有产物特异性的褐藻胶裂解酶来制备具有特定聚合度的褐藻胶寡糖具有重要的理论研究和应用价值。本项目首选对褐藻胶裂解酶进行结构域进行截断表达和表征。其中，N端CBM未显示出对于三种不同底物（褐藻胶、均聚甘露糖醛酸polyM和均聚古罗糖醛酸polyG）的降解活性；采用非变性底物亲和电泳实验对CBM的底物结合能力进行验证，表明CBM对于底物具有结合能力。C端催化域Alg7A-CD保留了降解三种不同底物的活力，说明催化域中含有维持酶活力所必须的关键位点；与全酶相比，Alg7A-CD在最适温度酶学性质上产生了一些差异，例如Alg7A的最适温度为30 oC，而Alg7A-CD的最适温度略有升高，达到了35 oC；Alg7A的最适pH为8.0，而Alg7A-CD的最适pH为9.0；与全酶相比，催化域Alg7A-CD的pH稳定性略有提升。采用薄层色谱TLC对两个酶的降解产物进行分析，发现催化域Alg7A-CD的产物分布变的更加复杂，从原来的以三糖为主，变成从二糖到五糖，由此可以推断CBM可能对于Alg7A特异性产生三糖具体调控的作用。鉴于蛋白结构数据库中已有与Alg7A酶序列一致性很高(70%)的蛋白结构(AlyB，PDB:5ZU5)，因此以AlyB为模板对Alg7A的结构进行同源建模和分析，表明Alg7A结构中N段包含8个折叠和一个小螺旋，C段则是一个典型PL7家族的夹心结构，底物识别过程中的关键位点为Gln385，His387和Tyr493，在催化过程中Gln385中和底物上的C5位糖环上的羧基所带的负电荷，His387和Tyr493分别作为催化过程中质子的受体和供体。以均聚甘露糖醛酸为配体分子进行分子对接，结果表明底物糖链可以进入狭长的活性口袋，其中底物非还原端的四糖单元正处于催化位点附件，糖苷键断裂位点在底物分子上的-1和+1位点之间，将其断裂为一个单糖和三糖；然后底物的后续部分再一次进入糖苷键断裂位点进行新的催化反应，依次循环。因此，从理论上阐明了该酶结构域功能和特异性产生褐藻胶三糖的催化机制，为进一步改造奠定了基础。