海洋嗜热新菌多结构域褐藻胶裂解酶的结构域功能和催化机理研究

Most of alginate lyases were produced from mesophilic bacteria, and they have important applications in alginate-derived oligosaccharide production and biomass degradation. AlgAT1 was one of the alginate lyases isolated from the fermentation broth of an novel thermophilic bacterial strain named Defluviitalea sp. Alg1. This enzyme has two predicted N-catalytic conversed domains and five predicted C-substrate binding conversed domains. It also has an enzyme activity half-life of 40 h, and bifunctional activity towards polyM and polyG. The catalytic activity under high temperature and multi-domain properties were never obvered in other reported alginases. Thus, the special enzymic and structure features are of importance to illustrate the catalytic mechanism and thermostability of alginate lyases. In this project, through expression of the conversed domains indivadully and assembly, multiple sequences alignment, three-dimensional structures determination, catalytic center site prediction, and site-specific mutagenesis study, reveal functions of the multi-domains and the possible catalytic mechanism of AlgAT1. Our research would enrich the categories of alginate lyase, help us to understand the catalytic mechanism and high temperature resistant mechanism in multi-domain enzymes, and supply theoretical basis for the molecular modification and industrial application of alginate lyase.

褐藻胶裂解酶多来自常温菌，在寡糖制备和生物质降解等方面有重要应用价值。AlgAT1是申请人从海洋嗜热新菌Defluviitalea sp. Alg1发酵液中纯化得到的褐藻胶酶，研究表明其N-端含2个预测催化结构域、C-端含5个预测底物结合结构域、60℃酶活半衰期超过40 h、具有对polyM和polyG的双功能酶活性等，多数酶学特征显著不同于已报道褐藻胶酶。因此该酶特殊性质和结构的解析对进一步认识褐藻胶酶的催化机理和热稳定机制意义重大。本课题以AlgAT1为研究对象，拟通过多结构域模块的重组表达，N-端结构域的同源比对、蛋白结构解析和催化活性中心预测，以及定点突变等研究手段，揭示多结构域的功能和催化域的作用机制。本课题的研究将丰富裂解酶的种类，从分子水平上揭示多结构域褐藻胶酶的耐热和催化机制，为褐藻胶酶的分子改造和应用提供理论基础。

通过对多结构域裂解酶Dp0100蛋白序列的生物信息学分析发现，该蛋白N-端催化结构域与已知序列存在18%的序列相似性，进化树分析显示其独立于已知的PL15、PL17和PL21家族的裂解酶氨基酸序列，形成一个独立的分支，支持其作为一个新的裂解酶家族。而对其中一个底物结合结构域的分析发现，它同样可以形成一个独立于已知底物结合结构域家族的进化分支，支持其作为一个新的底物结合结构域家族。通过构建TM1-7若干个截短突变体，对各个结构对酶学性质的影响进行了解析。结果显示，非催化结构域可以影响酶的热稳定性以及催化效率。通过负染电镜和底物亲和电泳，显示其对海藻酸钠糖链具有显著的结合能力，是首次发现的具有海藻酸钠多糖结合能力的结合域。通过蛋白结晶和X-射线衍射，解析出了催化结构域结构和多个酶-底物复合物结构。催化结构域结构由三部分组成，N端为α-螺旋结构，中间区域和C端是由β-折叠构成的三明治结构。通过结构比对和定点突变研究揭示出，H187、H405和Y239为关键的催化氨基酸位点。H187和H405的咪唑环分别位于底物的两侧，形成接近对称的结构，它们分别可以识别并脱去古洛糖醛酸和甘露糖醛酸C5位的氢，因此这两个组氨酸与底物的特异性密切相关。由N端结构和中间结构形成底物结合的谷地，其催化中心更加开放。对突变体H187A和甘露糖醛酸五糖的复合结构以及H187A和古洛糖醛酸六糖的复合物结构分析发现，蛋白的氨基酸残基R183、H185、N186、S127、Y135、N404、H407等主要通过氢键与底物结合，这些氨基酸基本可以识别不同类型的底物，这也很好的解释了该酶的双功能特性。本研究揭示出一个新的裂解酶家族的结构特征和催化机理，结合其它褐藻胶裂解酶家族结构的比较分析，一定程度上解释了褐藻胶裂解酶底物特异性的分子机理，为特异性褐藻胶酶的分子改造提供了理论基础。