多功能型微载体的构建及组织工程骨一体化制备方法的研究

利用间充质干细胞（MSC）制备的组织工程骨有望满足我国对高效骨移植物日益增长的临床需求,然而组织工程骨的传统制备方法步骤繁多，操作复杂，需反复使用酶消化。而文献表明酶消化会破坏细胞外基质,影响细胞功能和活性。本课题拟使用复合生长因子的脱钙骨基质和表面改性构建一种多功能型微载体，该微载体既可用于MSC的大规模扩增，又能作为组织工程支架材料直接用于组织工程骨构建；然后，结合我们先前研制的一台新型双轴向生物反应器，创建整合MSC扩增、分化和骨移植物构建为一体的组织工程骨一体化制备方法，以避免酶消化的使用；最后，将对该一体化制备方法的有效性进行体外、体内、细胞活性及骨缺损修复能力的综合评价，并对比传统制备方法,以探讨其作用机理。该一体化制备方法可简化组织工程骨的制备流程，有利其临床转化，并可能会增强其骨缺损修复疗效，而其作用机理的研究也有助于我们进一步了解细胞外基质在高效组织工程骨构建中的重要性。

微载体可用于干细胞的规模化培养，大幅降低组织工程技术的临床应用成本，目前虽然有多种商业化微载体，但是这些产品不可降解、不适合组织工程的体内应用。因此，研发组织工程专用的微载体，具有重要的临床转化意义。本研究采用脱钙骨基质（DBM）为原材料，通过冻干、粉碎、过筛的方法，制备了高骨传导性、生物可降解的DBM微载体，不但适用于干细胞扩增，还可作为支架材料用于组织工程骨微组织的一体化构建。. 本课题首先研究了DBM微载体的制备方法及材料表征。通过冻干、粉碎、过筛的方法，可制备可移植型的DBM微载体，其直径、表面积、密度等均与常用的商业微载体（Cytodex3）相近。基于该微载体，利用搅拌生物反应器，我们将骨髓间充质干细胞（BMSC）以动态接种于DBM微载体上，动态扩增培养细胞。DBM微载体的细胞接种率可高达73%，可在14天把细胞扩增4倍，且获得很好的细胞粘附及细胞外基质分泌效果。进一步实验表明DBM微载体扩增后的细胞仍然具有良好的干细胞干性、活性，满足种子细胞的动态扩增的要求。. 在此基础上，我们还进一步建立了组织工程骨一体化构建策略，在动态培养扩增后，使用成骨诱导液，进行动态成骨诱导，可构建基于DBM微载体的组织工程骨微组织。经过异位（大鼠皮下），原位（大鼠颅骨缺损）骨缺损修复研究，表明一体化构建的DBM组织工程骨微组织具有高成骨活性，可成功修复临界性骨缺损；此外，该策略还具备生物可降解、简化操作、减少重复酶消化、可自动化、规模化生产等优点，是一种极具临床转化潜力的新型微载体支架材料和工程化组织构建策略。.此外，在先前双轴旋转反应器的基础上，我们还研制了一种适用于微载体应用的迷你型的双轴旋转生物反应器，可用于该DBM微载体的动态扩增及组织工程骨颗粒的一体化构建。与现有的旋转或搅拌式反应器比，其剪切力更小，体积小，可配合常规离心管使用，成本低，维护简单，可降低其应用门槛。最后为了推进该微载体的临床转化，我们还建立了临床前大动物骨缺损模型：羊颅骨及狗下颌骨缺损模型。. 在该课题资助下，申请人发表SCI论文6篇（IF合计29分，5篇为第一或通讯，其中2篇IF>8），申请专利2项，培养研究生4名，发表国际会议受邀报告5次。