木薯淀粉品质改良的转基因关键技术研究

木薯是热带作物，由于木薯超常的高光效利用率，广泛的环境适应性，及块根淀粉率含量高，是国家可再生能源法中已明确指出的我国发展燃料乙醇生产的4个优选原料之一。农业部提出"十一五"建设热带、亚热带区域名优特产业带，木薯是重点发展的7大优势作物之一。木薯中的淀粉是生产酒精的工业原料。市场对木薯生产的基本要求是高淀粉产量和高酒精转化率。直链淀粉转化酒精的效率比支链淀粉高，所以木薯作为能源作物提高其直链淀粉的含量也是我国木薯未来发展的思路。本课题将研究：1、建立木薯高效遗传转化体系，研究木薯淀粉分支酶sbe基因，以及该基因的不同表达方式在木薯中对直链/支链淀粉的影响；2、探讨反义技术和RNA干扰技术对木薯直链/支链淀粉的影响；3、力求找到提高木薯直链淀粉的最有效转基因方法。最终实现筛选出遗传稳定的、块根中直链淀粉显著提高的生物质能源专用木薯新种质；为利用基因工程技术改良木薯淀粉品提供理论依据。

本研究从木薯块根中克隆了淀粉分支酶SBEI和SBEII基因，构建了由块根特异启动子（sporamin）启动的SBE基因的干扰和反义植物表达载体，转化根癌农杆菌GV3101，对木薯进行转化，获得了转基因植株。对转基因植株进行分子生物学和淀粉指标检测，分析了反义技术和RNA干扰技术对SBE基因在调控木薯块根淀粉直链和支链比例上的作用。本研究得到如下结果：（1）通过RT-PCR方法克隆了木薯块根SBEI、SBEII基因和块根特异启动子（sporamin），构建了反义和干扰植物表达载体，分别转化农杆菌GV3101，获得工程菌株。（2）通过对农杆菌介导的木薯遗传转化影响因素，包括外植体材料、培养基及激素配比、抗生素的选择压力，菌液浓度及培养条件等多种因素进行了系统研究，建立了高效的木薯遗传转化体系。（3）通过农杆菌介导法将干扰和反义SBE基因导入华南木薯SC6和SC8中，获得了一批抗性转化植株。经PCR检测，部分植株检测到了目的条带，初步证实目的基因已经整入到木薯基因组中，经RT-PCR检测和Northern杂交验证进一步证明內源基因在转录水平得到一定的抑制。（4）采用双波长比色法对在大棚生长6个月的转基因木薯及野生型对照进行了块根淀粉中直链淀粉含量的测定，结果表明：转反义SBE基因的转基因株系块根直链淀粉含量平均为31.85%，转干扰SBE基因的转基因株系中，直链淀粉含量平均为36.26%。其中直链淀粉含量增加较多的是转干扰载体的SBE8r1、SBE8r3、SBE8r8三个转基因株系，分别为38.23%、40.35%和43.57% ，差异达到极显著。由此说明，采用RNAi技术创造高直链淀粉木薯材料的效率要比反义技术的高。通过RNAi技术获得了直链淀粉含量比对照显著提高的3个转基因株系SBE8r1、SBE8r3、SBE8r8，有望培养出生物质能源专用型木薯新种质。