人肠道病毒71型抗病毒肽的筛选和机制研究

As the causative agent of hand, foot and mouth disease, Enterovirus 71(EV71) has been one of the major public health problems in China . No vaccine and effective post-exposure prophylaxis are currently available. The lack of effective prevention and treatment measures against EV71 may be attributed to no available effective chemical drugs. The aim of this research is to identify peptides, which could inhibit EV71 entering into the host cells or enzyme activity. In this study, peptide ligands binding to EV71 virus or VP1 would be selected from random peptide library displayed on filamentous phages, based on phage display screening and affinity selection. The inhibitory effect of these peptides against EV71 infection is determined by experiments in vivo and in vitro. Immune assay is used to identify the antiviral target of peptides, and Alanine substitutions is used to analyzed the antiviral activity of key amino acid. These peptides might be a new therapeutic strategy for the treatment of EV71 infection in the future.

人肠道病毒71型是引起手足口病的主要病原体，已成为我国重大公共卫生问题之一。目前缺乏有效针对EV71病毒的治疗药物， EV71疫苗研究处于临床试验阶段。近来，多肽类药物的发展为抗EV71病毒感染提供新的思路，本课题基于噬菌体展示技术，以EV71病毒颗粒和VP1蛋白为靶标，通过对7-mer和半胱氨酸限制肽库进行亲和筛选，寻找能阻断病毒与细胞结合或抑制病毒酶活性的多肽，达到抑制病毒侵染细胞的效果，通过空斑中和试验和动物试验验证多肽在体内外的抗EV71病毒活性，并利用免疫学技术研究多肽结合靶点，利用丙氨酸替换分析影响抗病毒活性的关键氨基酸，为抗EV71治疗性药物的研发和功能改进提供新的策略。

多肽类药物的发展为抗病毒感染提供新的思路，本研究基于噬菌体展示技术，以EV71病毒颗粒和VP1蛋白为靶标，对7-mer和半胱氨酸限制肽库进行多轮的亲和筛选，并表现一定程度的富集趋势，随机挑选噬菌体克隆通过与EV71病毒进行ELISA检测获得阳性克隆。对阳性克隆进行基因测序，分析其氨基酸序列，结果获得10条不同的多肽序列，其中9条为7mer随机肽库筛选，1条由环形多肽库筛选。多肽经生物合成后进行ELISA测定，两条多肽与病毒颗粒和VP1蛋白有结合活性，表明多肽可能结合与EV71病毒的VP1蛋白，但结合活性略低其他合成的8条多肽无明显的结合活性。以病毒感染和VP1真核表达的vero细胞进行免疫荧光检测，结果显示2条多肽与病毒颗粒的荧光检测显示较弱阳性。以微量中和实验结果发现1条多肽在原液作用浓度下对病毒有抑制作用，在1:2稀释梯度细胞病变部分减少，快速免疫荧光灶抑制实验也发现其对病毒灶有一定抑制作用，但抗病毒活性较低。后续将加强研究进一步进行功能研究和改进提升其抗病毒活性，为手足口的防治工作提供新的策略。