甲醇/山梨醇共混诱导条件下，毕赤酵母高效表达外源蛋白的转录组学机理及在线最优化控制研究

Methylotrophic Pichia pastoris is one of the most versatile systems for expression of heterologous proteins, and the addition of sorbitol in methanol induction phase effectively enhances the production of proteins. However, the molecular mechanism of the enhancement of the proteins production caused by methanol/sorbitol co-feeding is unknown. Meanwhile, the additions of methanol and sorbitol are manually-operated or controlled by feedforward strategies generally, resulting in the low efficiency of the application of methanol/sorbitol co-induction. To solve the problems, the transcriptional levels of all genes in cell under different methanol and sorbitol feed amount will be determined with the RNA-seq technique. The entire molecular mechanism of the enhancement of the proteins production will be revealed by GO and KEGG enrichment analysis. Moreover, the carbon flux to assimilation pathway will be taken as the optimization objective, the functional relationship between methanol and sorbitol feed rates and the objective will be fitted by support vector machine algorithm, and the optimal methanol and sorbitol feed rates will be calculated by differential evolution algorithm. Finally, the effectiveness and the versatility of the control strategy will be proved in the induction phases of 4~6 recombinant Pichia pastoris strains. This work has theoretical and practice significance for taking the advantages of methanol/sorbitol co-induction and further enhancing the production of large number of heterologous proteins.

甲醇营养型毕赤酵母是一种常用的蛋白表达宿主，在其甲醇诱导阶段添加山梨醇能够有效强化外源蛋白表达。然而，山梨醇强化外源蛋白表达的分子机制尚不明确，且甲醇和山梨醇流加大多仍采用人工或前馈式策略控制，尚未充分发挥甲醇/山梨醇共混诱导的优势。针对上述问题，本课题拟采用RNA-seq技术测定不同甲醇和山梨醇添加量条件下细胞样本的全基因转录水平，利用GO功能富集分析和KEGG代谢途径分析比较基因的差异化表达情况，进而全面解析甲醇/山梨醇共混诱导强化外源蛋白表达的分子机制。在此基础上，以同化途径的碳流量为优化目标，利用支持向量机算法在线拟合甲醇和山梨醇流加速率与优化目标之间的函数关系，并利用差分进化算法对甲醇和山梨醇流加速率进行在线寻优。最终，在4~6株重组毕赤酵母的诱导过程中验证该策略的有效性与通用性。本课题的开展对于充分发挥甲醇/山梨醇共混诱导的优势，强化多种外源蛋白表达具有重要的理论与现实意义。

本项目以甲醇营养型毕赤酵母高密度过程为研究对象，研究探讨了不同诱导条件下的毕赤酵母碳代谢以及能量代谢变化特征和模式，并提建立了若干甲醇诱导关键过程控制技术，提高了外源蛋白的产量或活性。主要论总结如下：（1）在极高细胞密度下，考察了“低甲醇浓度-高DO”条件（策略A）和“高甲醇浓度-低DO”条件（策略B）对毕赤酵母表达外源蛋白性能的影响。结果表明：Mut+型菌株的次优诱导策略为策略A，此时的产物浓度（HSA-GCSFm）达到使用策略B时的6.56倍；MutS型菌株的次优诱导策略为策略B，此时的产物浓度（pIFN-）达到使用策略A时的2.35倍。（2）利用转录组学分析探究现象的产生上述现象的机理。结果表明：在策略A下，Mut+型菌株碳源代谢和氨基酸合成相关基因上调，泛素-蛋白酶体合成相关基因下调。策略B下，MutS型菌株甲醇代谢和蛋白合成途径相关基因上调。（3）研究毕赤酵母利用甲醇的动力学特征。结果发现：在不同甲醇浓度下Mut+菌株利用甲醇的速度基本维持在恒定水平；MutS型菌株利用甲醇的速度依赖于甲醇浓度，并随甲醇浓度的下降而逐渐降低。据此，提出了Mut+和MutS型菌株表达外源蛋白过程中的甲醇利用速度动力学模型。（4）提出了一种甲醇周期诱导策略，即周期性地切换“高甲醇浓度-低DO”和“低甲醇浓度-高DO”诱导环境。采用此策略诱导两株MutS型菌株表达外源蛋白，pIFN-浓度和hLYZ活性比采用上述策略B时分别提高了86%和69%。（5）在低细胞浓度下诱导MutS型菌株生产Monellin，甲醇流向外源蛋白合成途径中的比例达到65.2%的高水平，且甲醇流向蛋白合成途径与能量代谢途径的比例匹配。同时，蛋白合成速度与细胞生长速度完全耦联且具有最大的耦联系数，细胞比生长速度也处于较高水平。Monellin的产量比高细胞浓度启动诱导的批次提高了150%~390%。