酸马奶中肠球菌所产细菌素特性及其相关基因的研究

With the improvement of living standards and awareness of food safety, research on broad-spectrum, efficient, safe and stable natural antimicrobial substances currently has become a main direction worldwide in the development of food preservatives. Lactic acid bacteria (LAB) are well-known for their ability to produce a variety of ribosomally synthesized proteins or peptides referred to as bacteriocins. Most Enterococins in Enterococcus are directly against food-borne pathogenic microorganisms, such as Listeria monocytogenes..Until now, there has been no report on the Enterococin in Koumiss by molecule method. In this study，enterococcus producing bacteriocin will be screened and identified from koumiss collected from the heardsman's houses in Inner Mongolia region.And biological characteristics of enterocin has been studied. Plasmid will be extracted and sequenced, its structure will be analysed.Genes related to enterocin production will be cloned and expressed，and its characterization of expression product will also be studied. The results of this project may be helpful to determine the antibacterial mechanism of enterocin and application of enterococci.

随着生活水平的提高和食品安全意识的增强，研究开发广谱、高效、安全、稳定的天然抗菌物质已成为当今国际食品防腐剂发展的主要方向。细菌素是乳酸菌通过核糖体合成机制产生的一类具有抗菌活性的多肽或前体多肽。乳酸菌中肠球菌(Enterococcus)产生的细菌素对食源性病原菌单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)等致病菌有强烈的抑制作用，因而具有作为食品防腐剂的潜力。 鉴于国内外对酸马奶中肠球菌素在分子方面研究未见报道，本研究以内蒙古牧区传统乳制品中的酸马奶为研究对象，对产细菌素肠球菌进行筛选、鉴定和肠球菌素的特性研究；利用分子生物学手段提取质粒、测序并绘制质粒图谱；克隆肠球菌素相关基因，构建原核表达载体并进行诱导表达和表达产物的生物活性研究，为今后进一步研究肠球菌素抗菌机理和肠球菌的应用奠定基础。

随着食品安全意识的增强，研究开发广谱、高效、安全、稳定的天然抗菌物质已成为当今防腐剂发展的主要方向。乳酸菌中肠球菌产生的细菌素对食源性病原菌作用显示了较强的防腐潜力。故本项目以分离自酸马奶中的乳酸菌为研究对象，进行抑菌菌株的筛选、鉴定及抑菌特性研究；选取抑菌活性强的乳酸菌基因组进行全序列测定及结构分析；并克隆肠球菌素结构基因，构建原核表达载体并进行诱导表达和表达产物的生物活性研究。.结果显示，17份样品中共分离到160株乳酸菌。采用琼脂扩散法，筛选出有较好抑菌功能的肠球菌5株，经生理生化试验和16SrDNA序列系统发育分析，鉴定为E. faecalis 8-1、E. faecalis G-3、E. faecium BZ2、E. faecium 1322和E. faecium MKW64，后期对5株球菌进行了抑菌物质理化特性的研究。.5珠菌所产抑菌物质所产抑菌物质经过胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶处理后，抑菌活性几乎完全丧失。抑菌物质在pH2.0-6.0范围内具有抑菌活性且对热稳定，对有机溶剂、部分表面活性剂、金属离子、紫外线处理均不敏感，能不同程度抑制多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。说明其产生的抑菌物质具有广谱抑菌作用。.选取抑菌最强的菌株BZ2进行基因组测序及基因功能预测，确定其对应的编码序列信息，为进一步研究该菌株的功能基因提供帮助。.通过PCR方法扩增得到E.faecium BZ2 EntA和EntB的基因片段，经琼脂糖凝胶电泳检测、连接、转化，选择单克隆并提取质粒，得到连接质粒pEASY-entA和pEASY-entB。选择单克隆并诱导表达，entB3.1和entA4.5在OD600为0.5-0.7，IPTG的终浓度为0.1 mmol/L，诱导时间在12 h下，表达效果最佳。其纯化及活性检测正在进行。.以E. faecium MKB64中提取质粒DNA作为模板，经PCR扩增、克隆，得到了entB目的条带。通过原核表达系统pET-32a(+)构建pentB、entB基因的原核表达载体，获得高表达的蛋白，经纯化、鉴定，发现Enterocin B对L. monocytogenes CMCC54002的生长有抑制作用。说明Enterocin B发挥抑菌作用的主要是其成熟肽，而并非含前导肽的前体肽。其成果为后续研究其抑菌机制及产品的防腐提供基础数据。