基于RNA-seq技术的黄连道地性形成的分子机制研究

Coptis chinensis is a well-known Chinese Geoherb, and the essence of genuineness formation in C. chinensis is that specific genes are initially regulated by given habitat conditions, and discrepant products are produced by spatial and temporal expression of key enzyme genes involved in some metabolic processes. However, current research work on genuineness resources in C. chinensis has been confined to the basic stage of survey, which can't substantially elucidate the genetic mechanism of genuineness formation in C. chinensis. In this background, this research is based on the differences in contents of secondary metabolites between the genuineness and the non-genuineness C. chinensis; we will utilize the high-throughput RNA-Seq (HTR) to quickly and completely obtain the differential expression transcripts from the C. chinensis samples of the non-genuineness and genuineness product areas. Then, the differential expression genes will be gathered and contrasted. In addition, we will utilize the real-time quantitative PCR (qRT-PCR) to detect the expression profiling of those genes involved in secondary metabolic processes. We also will demonstrate the significant relationship between the temporal and spatial differences of related genes which can potentially produce medicinal components in C. chinensis and habitat conditions, climate and other factors, thus resolving the molecular mechanism of genuineness formation in C. chinensis.

黄连 (Coptis chinensis Franch) 为我国著名道地药材，其道地性形成的实质是特定的基因，在特定的生境下受到复杂的调控，导致某些代谢过程的关键酶基因的表达产生了时空差异的产物。然而，我国目前针对黄连道地性资源的研究工作只局限于基础调研阶段，并不能从实质上阐明黄连道地性形成的遗传机制。在此背景下，本研究基于道地产区和非道地产区黄连次生代谢产物含量的差异，利用新一代高通量转录组测序技术全面快速地获得道地产区和非道地产黄连样品间差异表达的转录本，并将这些差异表达的基因进行富集比对，同时通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 检测其在黄连次生代谢过程中的表达情况，论证黄连药用成分相关基因表达的时序差异与生境、气候等因子的相关联性，最终解析黄连道地性形成的分子机制。

本项目按照任务书既定要求和研究计划，对道地产区（重庆石柱）和非道地产区（陕西镇平、贵州遵义）黄连样品的进行系统比对分析，解析黄连道地性形成的分子机制，顺利完成了课题各项研究任务，并取得了如下重要成果:（1）通过分析比对道地与非道地产区的气候、环境数据，发现不同产地来源的黄连药材质量表现出一定的地域化特征；（2） 应用HPLC测量不同产地黄连中次生代谢产物的含量变化，统计学手段评价不同产地次生代谢产物含量/丰度差异的显著性程度，发现黄连中总生物碱含量的积累与产区环境因子相关；（3）选择不同产地黄连中次生代谢产物含量呈现明显差异性的样品作为转录组测序的样品来源，成功构建了黄连转录组数据库（155,710 转录本和56,071 unigenes）；（4）运用生物信息学比对分析道地产区与非道地产区黄连样品的转录组测序序列，得到与次生代谢产物差异表型相关的差异序列和这些序列的GO功能分类以及所参与的代谢通路Pathway，明确了这些差异基因在不同黄连样品中的表达量，论证了黄连药用成分相关基因表达的时序差异与生境、气候等因子的关联性；（5）建立了黄连生物碱合成相关功能基因c101794、c168605、c175479、c177134、c150791、c156287、 c162923、c129387、c165925和c174243的实时荧光定量PCR的检测方法，发现不同产地黄连功能基因的表达水平表达水平与药材质量具有相关性；（6）建立了以药材质量分析、遗传多态性、功能基因表达水平、功能基因序列差异等多层次综合研究技术平台，开创了以功能基因为核心的黄连道地性形成机制的新型研究模式。