巨噬细胞谷氧还蛋白Grx1调控丙酮酸激酶PKM2的谷胱甘肽化参与高氧性肺损伤的机制研究

Although hyperoxia was used as a therapy improving outcome following a variety of diseases, it can also induce some injuries, especially, hyperoxia induced lung injury, which becomes a limiting factor in its clinical application. Our study finds that Grx1 mediated protein glutathionylation of macrophage plays an important role in hyperoxia induced lung injury. According to the results of Mass spectrometry screening method and in vitro experiments, we find that oxidative stress can lead to an increase in PKM2-SSG level of macrophage. In addition, the results indicate that Inhibition of PKM2 by glutathionylation suppresses the glycolysis of macrophage and the expression of inflammation cytokines. Our project will use GRX1-/- mice, glutathionylation sites mutation mice, primary macrophage, macrophage cell line, as well as peripheral blood mononuclear cells from patients, to verify glutathionylation sites of PKM2, to detect the location of PKM2-SSG, to study the influence of PKM2-SSG on the formation of dimer and tetramer as well as its related signal pathways. Importantly, clarifying the molecular mechanism of macrophage polarization regulated by the glutathionylation of the key glycolytic enzyme PKM2, may provide theoretical and practical basis to improve the effectiveness of oxygen therapy use and reduce the lung injury.

高氧已被广泛应用于缺氧、缺血、感染等多种疾病的治疗，但其引发的高氧性肺损伤等潜在风险限制了临床上高氧的应用。氧化应激在高氧性肺损伤中发挥了重要作用，此外越来越多的实验证据表明代谢酶可直接参与炎症性疾病的病理过程。本课题组前期通过Grx1-/-小鼠发现其参与高氧性肺损伤的调控，质谱筛选发现Grx1可调节氧化应激状态下巨噬细胞中PKM2的谷胱甘肽化修饰，PKM2的谷胱甘肽化抑制其丙酮酸激酶活性，从而影响巨噬细胞的糖酵解及炎症因子表达。本项目将在已有研究基础上进一步检测PKM2谷胱甘肽化位点及其对酶活和转录调控功能包括细胞内定位、二聚体/四聚体形成等影响。通过构建PKM2修饰位点突变的Knock in小鼠、临床病人外周血单核细胞等验证并深入探究糖酵解关键酶PKM2的谷胱甘肽化调控巨噬细胞活化和炎症反应、参与高氧性肺损伤的分子机制，为更有效的利用高氧治疗疾病、减少肺部损伤提供理论基础和实践依据。

高氧治疗是一种临床上常用的治疗手段，但高浓度、长时间的氧疗易引发肺等器官的损伤，限制了其临床应用。高氧性肺损伤是高氧治疗在临床上常见的并发症，它的发生和氧化应激密切相关，但其具体的调控机制仍有待进一步研究。氧化应激状态下，蛋白质上的半胱氨酸残基(-SH)和谷胱甘肽(Glutathione，GSH)可以形成混合型二硫键(Protein-SSG)，发生蛋白质的谷胱甘肽化，其去谷胱甘肽化过程主要由谷氧还蛋白(Glutaredoxin-1，Grx1)催化。目前，绝大多数蛋白发生谷胱甘肽化修饰后的功能改变及其体内生理学意义尚不明确。我们利用实验室已引进的Grx1敲除(Grx1-/-)小鼠探究蛋白质的谷胱甘肽化在高氧性肺损伤疾病进程中的作用及其调控机制。研究发现Grx1缺失及蛋白质的谷胱甘肽化增加可显著缓解高氧诱导的肺损伤。此外肺脏主要组成细胞中，巨噬细胞对氧化应激最为敏感，且Grx1缺失的高氧造模组小鼠肺泡巨噬细胞中谷胱甘肽化水平显著增加，据此我们推测巨噬细胞在高氧性肺损伤的疾病进程中发挥了重要功能。我们采用了改良的谷胱甘肽化蛋白定量质谱筛选技术揭示了在氧化应激环境中，通过谷胱甘肽化修饰调控巨噬细胞功能的关键蛋白。质谱筛选、分子水平、细胞水平等实验结果发现，脂肪酸结合蛋白5(Fatty acid-binding protein 5，FABP5)可以发生蛋白质的谷胱甘肽化修饰，同时这一修饰伴随着蛋白二聚体和寡聚体的形成。并且在氧化应激环境中，巨噬细胞中FABP5的谷胱甘肽化修饰显著增强。FABP5是一种低相对分子质量的脂质伴侣蛋白，可以参与调控脂肪酸摄取、转运、代谢及炎症调控等多种生物学过程。我们发现FABP5的谷胱甘肽化促进了其与脂肪酸的结合，且 FABP5 和脂肪酸结合后促进了 FABP5的核转位，FABP5携带配体入核后可激活PPARβ/δ通路，从而抑制巨噬细胞炎症。FABP5 127位点半胱氨酸是谷胱甘肽化修饰位点之一，当 FABP5 127位点半胱氨酸突变为丝氨酸后，FABP5的谷胱甘肽化、脂肪酸结合能力、核转位、抑制炎症功能均受到抑制。我们的研究阐明了FABP5能够通过其半胱氨酸127位点的谷胱甘肽化修饰参与调控巨噬细胞的活化。研究结果为使用氧化还原策略靶向治疗疾病提供了新思路，为临床上更有效的使用高氧治疗疾病、降低肺部损伤风险提供了理论基础和实践依据。