高氧致肺损伤新生鼠Occludin蛋白开放肺上皮屏障及其调控机制的研究

为研究肺上皮屏障开放在高氧肺损伤发生中作用机制及探索有效干预途径。在前期工作已证实肺水肿阶段存在紧密连接相关蛋白Occludin低水平表达的基础上，制备高氧致新生鼠肺损伤模型，分别采用原代培养新生鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞及人A549细胞建立体外肺上皮屏障模型：首先从组织水平，通过免疫荧光等技术，阐明肺上皮Occludin蛋白分布特点及其对屏障通透性的影响；通过跨上皮阻抗测定及透射电镜观察，在体外证实Occludin蛋白对肺上皮屏障结构及功能的调节作用；合成Occludin启动子寡核苷酸序列，构建不同的表达质粒共同转染培养的细胞，利用荧光素酶报告基因实验，确认基质金属蛋白酶-9（MMP9）对Occludin转录调控能力；分别应用RNAi抑制MMP9基因表达及MMP9抑制剂（GM6001）作用实验，在体外、体内同时证实，消减MMP9抑制Occludin表达，对维持肺上皮屏障结构及功能完整的保护作用。

支气管肺发育不良（BPD）是早产儿常见的合并症之一，虽病因复杂，但早期肺水肿的病理变化已被证实，有关其发生机制目前多认为与氧化应激反应、炎症因子所介导的肺毛细血管通透性增强有关。本项目在前期工作基础上，通过研究肺上皮细胞紧密连接（TJ）结构及功能的改变，揭示BPD早期肺水肿的分子调控机制。建立BPD动物模型、原代培养新生鼠AT-Ⅱ细胞及制备体外肺上皮屏障模型，利用Western blot及Real time-PCR技术，测定肺组织及AT-Ⅱ的TJ相关蛋白及基因表达，通过免疫荧光技术观察肺上皮ZO-1、Occludin蛋白定位，利用透射电镜观察肺上皮屏障TJ的结构改变，通过跨上皮电阻观察肺上皮的通透性改变，发现肺上皮屏障开放是BPD早期肺水肿的关键环节，并进一步验证TJ相关蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-4表达均下调，但闭合小环蛋白ZO-1最明显，其次是咬合蛋白Occludin，表明ZO-1、Occludin表达下调所介导的TJ结构破坏和功能改变，是导致肺上皮屏障开放的重要机制。在建立体外肺上皮屏障模型的基础上，采用MMP9抑制剂GM6001体外干预肺上皮细胞，进一步阐明了过度表达MMP-9破坏了TJ的结构和功能，拮抗MMP-9后，可以上调ZO-1表达，逆转TJ的结构和功能改变。在动物整体及细胞水平，利用Western blot、Real time-PCR及免疫荧光等分子生物学技术，同步验证了BPD发生中，存在Caveolin-1基因及蛋白的表达下调，但其表达减少的发生要先于TJ相关蛋白，并通过构建Caveolin-1基因低表达和过表达细胞模型，进一步验证，上调小窝蛋白Caveolin-1，明显改善肺上皮紧密连接结构破坏及功能失常。因此，本项目不仅率先提出肺上皮屏障开放是BPD早期肺水肿的关键环节，并从新的角度揭示了其发生的分子调控机制，为临床有关BPD的有效防治途径的重新设计奠定了实验基础。