高温胁迫下半夏SSH文库的构建及倒苗相关基因的克隆与功能分析

目前，由于对半夏高温倒苗分子机理了解的欠缺，人工调控技术发展缓慢，从而严重制约了半夏生产的发展。因此，研究半夏高温倒苗的分子机理及调控，对于半夏栽培和产业的发展等具有十分重要的意义。本研究拟选用高温胁迫前后的半夏植株为材料，采用抑制差减杂交（SSH）技术分离与高温胁迫和倒苗密切相关的表达基因ESTs，建立半夏高温倒苗相关基因表达的转录谱；同时利用生物信息学和杂交对比分析，筛选出半夏高温胁迫和倒苗的相关基因；通过RACE技术克隆候选基因的全长cDNA，然后通过基因表达谱分析、转基因超量表达和抑制表达（RNAi）进行候选基因的功能验证。从而明确半夏高温胁迫和倒苗的分子机理，为进一步调控半夏高温胁迫和倒苗提供重要的理论依据。

本研究以高温胁迫和未经高温胁迫的半夏叶片及叶柄为材料，采用抑制差减杂交（SSH）技术构建了半夏高温胁迫的消减文库。消减文库构建完成后，对文库中的332个阳性克隆提取质粒并测序，去除低质量及载体等序列后，共获得高质量序列303个。对序列进行分析后发现。对该转录组进行了GO功能分类预测，有228个gene可注释为不同的GO terms。在分子功能分类中与结合相关的EST占64.5%、催化活性相关的ESTs占24.6%；生物过程分类中与细胞过程相关的ESTs占22.4%、生物调解占4.5%、刺激响应占38.8%、代谢过程占24.3%。 . 文库中4个特异性EST序列分别与HSP70（热激蛋白70）、HSP90（热激蛋白90）、 sHSP（小热激蛋白）、SAD（硬脂酰脱氢酶）基因同源性较高。利用定量PCR技术分析4个基因的表达模式，研究发现半夏在高温胁迫过程中PtHSP70、PtHSP90、 PtsHSP 3个基因上调表达而PtSAD基因的表达量则呈下调趋势。依据半夏消减文库中PtSAD基因EST片段信息，利用5’-RACE和3’-RACE方法扩增出半夏PtSAD 5’片段和3’片段，推测编码 394个氨基酸。利用相同方法克隆得到PtsHSP全长基因序列，其包含852bp，推测编码 155个氨基酸。. 半夏在高温胁迫过程中，会特异性表达热激蛋白基因。同时也会诱导脂肪酸代谢过程相关酶基因表达量的变化，其中硬脂酰脱氢酶（PtSAD）作为脂肪酸脱氢的初级代谢酶，通过该基因的下调可以减少不饱和脂肪酸的含量，进而提高半夏耐热性。通过该项目的实施，初步明确了半夏高温倒苗的分子机理，为今后开展半夏倒苗分子调控和种质资源分子育种创新的研究奠定了基础，同时对植物耐受高温逆境的研究具有重要的理论和实践意义。. 项目共发表相关学术论文8篇（其中SCI收录2篇）；项目组成员在基金资助期间，共参加9次国内外学术会议，交流会议论文8篇，作口头报告8次，5名硕士研究生完成学业获得硕士学位，另外有6名硕士研究生在读。获得教育部科技成果1项，安徽省科技进步奖1项，申请国家发明专利1项。相关成果的详细目录见结题报告。