半夏应答遮荫调控的转录组差异分析及关键基因的克隆和功能鉴定

Pinellia ternata (Thunb.) Briet. is shade-requiring plants. Under high temperature and strong light, the aerial parts will wither, commonly known as the sprout tumble. Numerous studies showed that production of P. ternata tubers were increased under shading treatment. So far, based on extreme shortage of genetic information from P. ternata, research was seriously affected on plant growth and secondary metabolites of tubers related to shading treatment. In this project, transcriptional library and cDNA subtractive library will be established by transcriptome sequencing from leaves and tubers of P. ternata under shading treatment and full light treatment.The candidate genes that are closely related to shading treatment can be screened by bioinformatic analyzing. Afterward, the genes are taken functional verification through quantitative PCR,genetic transformation. Finally, the molecular mechanisms that effects of shading treatment on plant growth and secondary metabolism of P. ternata would be revealed in gene expression. It will provide a theoretical basis not only for high yield and quality cultivation of P. ternata, artificial regulation, but also for molecular breeding.

半夏为喜阴植物，人工栽培中由于夏季强光照射和高温等环境胁迫引起大量倒苗，遮荫处理可延缓半夏倒苗、显著提高块茎产量。目前，由于半夏遗传信息的匮乏，严重影响了对遮荫处理调控半夏生长和次生代谢的深入研究。为突破这一瓶颈，本研究拟选用不同遮荫处理的半夏植株为材料，利用转录组测序构建半夏块茎和叶片的cDNA差减文库和转录谱。经生物信息学和GenBank数据库检索分析获得差异片段ESTs可能的基因结构和功能，筛选出遮荫调控半夏生长和次生代谢相关基因。根据转录谱分析差异基因片段的信息，通过RACE技术获得候选基因的全长cDNA。然后通过转基因超量表达和抑制表达（RNAi），结合定量PCR、Northern Blot等方法进行候选基因的功能验证，获得遮荫调控半夏生长和次生代谢的关键基因，从而初步揭示遮荫调控半夏生长和次生代谢的分子机制，为今后实现半夏高产优质栽培、人工调控和分子育种设计提供理论依据。

半夏为喜阴植物，人工栽培中由于夏季强光照射和高温等环境胁迫引起大量倒苗，遮荫处理可延缓半夏倒苗、显著提高块茎产量。目前，由于半夏遗传信息的匮乏，严重影响了对遮荫处理调控半夏生长和次生代谢的深入研究。为突破这一瓶颈，该项目借助二代转录组和三代全长测序分析光照组与遮荫组两种材料的转录组水平差异，建立了遮荫调控半夏生长和次生代谢的相关差异表达基因ESTs和转录谱。采用超高效液相色谱-串联质谱联用（UHPLC-MS）的代谢组学方法评估了遮荫对半夏药用主要成分的影响，差异代谢物分析表明遮荫主要促进半夏块茎中甲羟戊酸、γ-氨基丁酸、苯丙氨酸和尿烷酸等几种有机酸的积累，而半夏中相关生物碱含量变化不显著。同时，项目开展了外源诱导子对半夏悬浮细胞和离体小块茎中生物碱合成影响的研究。半夏悬浮细胞和小块茎为培养系，发现适量浓度的茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）浓度对细胞中总生物碱含量、鸟苷，肌苷、麻黄等生物碱的合成影响显著、含量提高；qRT-PCR分析表明，生物碱生物合成关键酶候选基因CNL、CHY和BALDH显著上调，生物碱合成相关酶（IMP 脱氢酶、sAMP合成酶）的活性也显著提高。基于转录组和基因表达验证分析，通过遗传转化体系对候选基因进行了功能验证，结果显示遮荫可显著促进半夏蔗糖合成酶（PtSUS）和半夏过氧化氢酶(PtCAT)基因表达量的提升，因此我们克隆了这两个基因并构建了其超表达载体，并浸染转化拟南芥，比较高温胁迫胁迫条件下转基因拟南芥与野生型拟南芥的表型，结果显示转基因拟南芥在高温胁迫下的存活率显著高于野生型。项目研究结果初步揭示了遮荫调控半夏生长和次生代谢的分子机制，为今后实现半夏高产优质栽培、人工调控和分子育种设计提供了理论依据，并为今后半夏大田栽培通过外源生长调节剂提高半夏品质提供了思路和技术支持。