鼻咽癌抑癌候选新校正基因NESG1相互作用靶分子的筛选及鉴定

申请者在其承担的前一个国家自然科学基金资助下已经证明，新校正的NESG1基因在鼻咽癌发病过程中发挥了抑制肿瘤生长的作用。进一步研究需要明确NESG1与何基因发生直接相互作用，从而介导了下游的抑制性信号通路。因此，我们将构建正常鼻咽上皮酵母双杂交cDNA文库，然后利用酵母双杂交技术在该文库中筛选NESG1基因直接相互作用的靶分子。随后，采用GST pull-down、免疫共沉淀以及共定位分析等方法对NESG1作用靶蛋白进行体内体外实验验证，并对确定的靶分子在鼻咽癌中的表达进行检测分析。如该实验顺利进行，将为阐明NESG1基因在鼻咽癌中介导的抑制性信号通路提供关键性线索。

在本次研究中我们首先发现降低的NESG1表达促进了鼻咽癌发病的进展和可怜的预后。利用慢病毒介导的shRNA抑制NESG1过表达通过恢复CCNA1表达以及抑制p21表达以及调节MAPK信号通路能恢复鼻咽癌细胞生长、游走和侵袭。进一步，我们利用蛋白质组学的方法鉴定癌基因ENO1被NESG1负性调控。该基因过表达能克服NESG1抑制效应，上调CCNA1表达以及抑制p21表达，从而恢复鼻咽癌细胞的生长。我们的研究表明，NESG1是鼻咽癌一个潜在候选抑癌基因。除此之外，我们依据标书内容还进行了如下工作：1）利用酵母双杂交的方法筛选了NESG1直接相互作用蛋白；2）利用免疫共沉淀和采用激光共聚焦进行细胞内共定位的方法验证NESG1直接相互作用蛋白；3）验证了NESG1直接相互作用蛋白在鼻咽癌组织中的表达以及与NESG1在鼻咽癌组织中的表达相关性。我们结果显示，利用酵母双杂交筛选了VPS33B等9个候选相互作用蛋白。在利用免疫共沉淀验证了VPS33B、CCDC65、RNF2以及ENKUR 4个蛋白后（另外5个基因还未验证），发现只有VPS33B能直接与NESG1基因发生结合。进一步激光共聚焦能显示NESG1与VPS33B在鼻咽癌细胞胞浆中共定位。最后，我们还发现，VPS33B在鼻咽癌组织中表达明显下调，且下调的VPS33B在鼻咽癌中与NESG1表达呈正向性相关性。