肝癌抑癌候选新基因HSPC238相互作用蛋白的筛选与鉴定

HSPC238是一个新的含RING指的C3HC4型锌指蛋白。2008年3月Brophy TM等首先报道其具有E3酶活性，随后再未检索到有关其功能研究的报道。锌指蛋白是一类重要的转录调控因子，研究提示含RING指的锌指蛋白不仅具有E3酶活性，还可参与基因转录调控及肿瘤抑制等多种生物学过程。特别是若将其研究结果应用于人工转录因子的构建，将为药物开发和基因治疗提供新思路。为此，含RING指的有E3酶活性的HSPC238蛋白引起了我们的关注。我们的前期实验已证实该基因在体内外均能明显抑制肝癌细胞的增殖和侵袭；采用2D结合MALDI-TOF/TOF技术也发现其能在SMMC7721细胞中明显下调多个致癌蛋白。为进一步明确该蛋白的功能，本课题拟采用酵母双杂交、RNA干扰、pull down及免疫共沉淀等方法筛选并鉴定其相互作用蛋白、探讨它的作用网络，为达到从锌指途径寻找肿瘤治疗新靶点的最终目标奠定基础。

2008 年3 月Brophy 等首先报道HSPC238具有E3 酶活性，随后再未检索到有关其功能研究的报道。我们的前期实验已证实该基因在体内外均能明显抑制肝癌细胞的增殖和侵袭；采用二维MALDI-TOF/TOF 技术也发现其能在SMMC7721 细胞中明显下调多个致癌蛋白。为进一步明确该蛋白的功能，本课题在项目基金的资助下，完成了以下系列实验：.（1）筛选：采用酵母双杂交技术初步筛选到与HSPC238可能相互作用的一组蛋白，经查阅文献，初步锁定四种蛋白质（HMOX-1、MT2A、RPS27a、Ubb，以下简称目标蛋白）作为下一步研究的对象；.（2）验证：激光共聚焦实验结果显示，目标蛋白与HSPC238蛋白共定位于细胞浆，证明二者存在空间相遇。再通过pull down及免疫共沉淀技术进一步证实HSPC238与目标蛋白在体内外均存在相互作用；.（3）影响和调节：前期通过动物实验证实，转染HSPC238可明显促进小鼠体内实体瘤的生长。本课题通过在HEPG2细胞内过表达（及干扰）HSPC238后，分别采用RT-PCR和WB法检测目标基因和蛋白的表达水平。结果表明外源性干扰HSPC238后，MT2A等目标蛋白/基因的表达明显下调；外源性过表达HSPC238后，MT2A等目标蛋白/基因表达水平也随之上调。.（4）调节途径：分别转染pcDNA3.1-目标蛋白于稳定高表达（或低表达）HSPC238细胞株，镍柱纯化目标蛋白，以HSPC238做免疫印迹，对照组以MG132(10uM)处理细胞，较未处理细胞组条带增加，这表明泛素化的目标蛋白在MG132抑制蛋白酶体活性后大量累积。实验结果表明，目标蛋白通过泛素蛋白酶体途径（UPP）进行代谢，HSPC238可能通过UPP对目标蛋白进行调节； .（5）调节机制：把目标蛋白过表达载体分别与低（或高）表达HSPC238的细胞转染，检测细胞增殖与侵袭能力，结果表明，过表达目标蛋白后，细胞增殖能力及侵袭能力均相对增强。这说明HSPC238是通过对目标蛋白的调节来影响肝癌细胞的生长的，但其具体调节机制，仍有待后续进一步研究探讨。. 通过本项目的研究，已在国内核心期刊发表相关学术论文4篇，另有5篇在投，申请国家发明专利一项，获得市科技进步二等奖一项，取得了预期成果。