金黄色葡萄球菌gdpS基因调控致病靶基因的特殊分子机制研究

Staphylococcus aureus is an important human pathogen, which can cause many infectious diseases by producing a range of virulence factors. The production of these factors is modulated by a complicated regulatory network, including a series of transcription factors (mainly including the Sar homologue), two-component regulatory systems, quorum sensing systems and small non-coding RNAs. However, the research of the detailed regulatory mechanisms still remains insufficient. Our previous work found that the inactivation of gdpS affected the production of many virulence factors, suggesting that gdpS plays an important role in virulence regulation in S. aureus. Furthermore, we found that gdpS can regulate the production of protein A, not by the protein coding by gdpS, but by the RNA it transcribes. It indicates that the mRNA coding by gdpS not only acts as the messenger RNA, but also can work as a regulatory RNA, like the known regulatory non-coding RNAs. In this study, we will investigate the detailed molecular mechanism of how gdpS regulates protein A and other downstream targets, in order to adding the knowledge of virulence regulation in S. aureus.

金黄色葡萄球菌（金葡菌）是重要的人类致病菌，可产生多种致病因子对宿主产生破坏作用从而引起多种病症。金葡菌致病因子的分泌受到其自身调控网络的精细调控, 包括一系列的转录因子（Sar蛋白家族为主）、二元信号系统、群体感应系统以及非编码小RNA等，但其详细机制的阐述仍存在不足。我们的前期工作发现金葡菌gdpS基因的缺失能够影响一系列致病因子的表达，在金葡菌致病性调控中作用关键。进一步研究发现，gdpS基因行使对protein A的调控功能，并不依赖于其编码的蛋白形式，而是依赖于其转录出的RNA形式，即gdpS编码出的mRNA不仅可以作为信使RNA当作蛋白翻译的模版，它还是一个具有调控功能的RNA形式，类似于我们所知的具有调控功能的非编码RNA。我们希望阐明gdpS调控protein A及其他下游靶点的详细分子机理，从而深化和丰富对金葡菌致病性调控的认识。

Protein A（spa）是金黄色葡萄球菌中重要的表面蛋白，能够与多种哺乳动物免疫球蛋白IgG的Fc区域结合，帮助细菌进行免疫逃逸。在金黄色葡萄球菌中，spa受到复杂的网络调控，其中SarA能够抑制spa的表达，而SarS可以通过与spa启动子直接结合对spa进行激活。环二鸟苷酸c-di-GMP是细菌中普遍存在的第二信使，能够参与多种病原体的毒性调控。环二鸟苷酸c-di-GMP由含GGDEF结构域的鸟苷酸环化酶环化两个GTP分子而成，并由含有EAL或HD-GYP结构域的磷酸二酯酶水解成pGpG或两个GMP分子。在金黄色葡萄球菌NCTC8325中，只发现一个编码保守GGDEF结构域的基因gdpS，并未发现含EAL或HD-GYP结构域的基因存在。. 本项目以我们前期的研究结果为基础，我们前期工作中发现gdpS的失活将引起protein A及SarS的表达变化，并发现gdpS对spa和sarS的影响主要依赖于其N端结构域编码序列，而不是C端c-di-GMP的合成结构域的编码序列，证明gdpS的调控功能与c-di-GMP无关，但详细分子机制不详。本项目即是以gdpS调控spa的详细的详细分子机制作为主要研究内容，结合生理、生化、分子生物学等多种研究手段展开了研究工作并且取得了重要发现，即我们首次发现gdpS的mRNA以类似于非编码小RNA的方式通过与sarS的mRNA直接作用而对其产生调控效应。本研究首先利用定点突变与回补实验证明gdpS的蛋白产物不参与sarS的转录调控，进而利用Northern blot检测gdpS上可能存在的转录本，排除了gdpS编码转录sRNA的可能性，并通过凝胶阻滞实验分析证明gdpS mRNA可通过直接的RNA-RNA相互作用与sarS mRNA的5’UTR进行碱基配对。此外我们还利用定点突变、荧光定量PCR等实验成功预测出两个gdpS mRNA上的18个功能碱基。最后我们发现gdpS能够通过增强mRNA稳定性的方式，提高胞内sarS mRNA的水平。. 本项目证实gdpS基因可以通过其编码的mRNA直接行使分子调控功能并详细阐明了其分子机制，这一发现不仅为蛋白编码基因的多功能性研究提供了新的实验证据及思路，同时gdpS mRNA作为金黄色葡萄球菌中最新发现的双功能RNA，也将更有利于对细菌中调控RNA的进一步了解。