光动力学疗法（PDT)上调胶质瘤细胞TAP1表达的转录调控机制

我们首次发现，光动力学疗法（PDT）处理可上调胶质瘤细胞抗原转运相关蛋白TAP1,从而提高肿瘤细胞免疫原性，激活抗肿瘤免疫，对增强PDT疗效有着重大的意义。但胶质瘤细胞TAP1基因上调的转录调控机制是什么？至今尚不清楚！本项目拟建立PDT处理人脑胶质瘤细胞模型，在TAP1启动子荧光素酶报告载体基础上构建5＇端删除连续突变体重组子，确立PDT诱导TAP1表达的启动子核心区以及可能存在的转录因子结合位点。进而用EMSA技术确定TAP1基因启动子核心区的结合序列是否能够与这些转录因子结合；ChIP方法获得转录因子与TAP1启动子核心区在细胞内结合的证据。并用SiRNA和构建的转录因子真核表达载体抑制/增强转录因子表达，观察TAP1启动子核心区已知转录因子（Sp1、CREB、NF-κB等）的结合序列是否介导了TAP1基因的转录调控。进一步阐明PDT处理下胶质瘤细胞TAP1基因上调的转录调控机制。

本课题是以前工作的继续和深入。在前期工作中，本课题组利用弱酸洗脱法，获取PDT处理后肿瘤细胞表面MHC-I类结合肽，反复冲击致敏自体DC，成功制备DC疫苗,并检测CTL活性。结果发现， PDT处理后所诱发的体外细胞毒效应明显增强，肿瘤细胞抗原免疫原性也显著提高。上述试验结果已以数篇论文形式发表。. 为了进一步探讨PDT增强肿瘤细胞免疫原性的分子生物学机制，本研究组对抗原加工处理呈递相关分子中核心蛋白TAP1进行了研究，结果发现：PDT上调胶质瘤细胞TAP1基因转录及蛋白表达；PDT增强TAP1转运抗原肽的活性继而增加MHC-I:抗原肽复合体在胶质瘤细胞表面的展示，最终激活CTL。这是我们首次发现并予报道，相关结果已发表于国际神经肿瘤领域著名期刊《journal of neuro-oncology》。. . 我们使用miRCURYTM LNA Array对光敏剂HMME光动力处理后人胶质瘤细胞及未处理人胶质瘤细胞的miRNA表达谱进行了检测，发现结果显示，共79个miRNA表达水平在胶质瘤细胞PDT处理前后存在明显差异，其中光动力处理后表达上调的有43个，表达下调的有36个。. 生物信息学分析显示多个在PDT处理后表达下调的miRNA以TAP1或NF-κB为靶基因，这表明TAP1基因的表达受到miRNA的直接调控或者由miRNA调节NF-κB而间接调控TAP1基因的表达。我们的预实验也证实在PDT处理后人胶质瘤细胞的TAP1以及NF-κB基因的表达水平显著升高. . 我们应用慢病毒载体系统（Tronolab公司）构建并装配携带miR-346的慢病毒载体（Lenti-miR-346），鉴定慢病毒载体转染效率后，将其转导人胶质瘤U251细胞，并通过慢病毒携带的GFP报告基因分选转导成功的细胞。